1 引言

　　淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称[1],是一种能使糖原水解和催化淀粉转化为葡萄糖、麦芽糖等糖类及一系列其它低聚糖的酶类[2]。淀粉酶大部分存在于动植物和微生物中[3]，其中微生物的酶几乎都是分泌的，给酶液的分离提供了便利。目前，淀粉酶制剂是至现在为止产量最多、作用最广泛的酶制剂品种。同时淀粉酶制剂也是最早实现工业化生产的酶制剂[4]。淀粉酶的家族主要包括四类，一：α-淀粉酶;二：β-淀粉酶;三：葡萄糖淀粉酶;四：异淀粉酶[5]，其中α-淀粉酶最主要的工业产品[6]。目前工业上主要以微生物发酵法来大规模生产α-淀粉酶。淀粉酶制剂是一种重要的生物工业催化剂，淀粉酶家族种类多，并且特点各异，大多数都应用在食品加工、发酵工业[7]、医药行业、酿造产业、化学工艺、还有洗涤剂、工业副产品及废料的处理、饲料工业及微生态制剂等多种领域[8]。我国是农作物大国，淀粉生产量大，储备足，随着我国科学技术的突飞猛进，酶制剂工业也发展迅速，淀粉酶的种类和产量也在不断突破;尽管如此，但我国的酶制剂产品同发达国家依然差距显著，存在着很大的缺点，无论是淀粉酶的种类，还是生产菌株都比较贫乏[9]。所以在应用方面比较局限，不能有较大的发展，虽然近年来同国际的酶制剂工业有了更广泛的接触和交流，但在食品加工、洗涤剂工业、酒精发酵、果汁生产等方面依然远超于国内的生产水平，尤其是在20世纪中期到现在，通过酶的方法生产葡萄糖以及利用葡萄糖来生产其他的糖浆种类等工艺都比国内的水平先进。就当前的科技技术水平来讲，除了展开了大量的筛选野生型菌种，进行诱变育种的工作外，基因工程技术的应用，给得到高产淀粉酶菌株提供了一条新的途径，国外已经开始通过淀粉酶基因型序列对淀粉酶生产进行基因调控，通过实验进行探讨并将其转化为基因克隆的育种技术，例如将枯草芽孢杆菌重组体的基因导入特定菌株，通过这种方法使淀粉酶的产量大大提高，并且在工业生产和使用中得到了广泛的应用[10]。我国丰富的淀粉资源丰富为淀粉酶工业提供了高速发展的土壤，与国外先进的酶工艺技术的交流对我国酶制剂工业的发展同样有重要的影响。虽然现在我国同国外酶制剂工艺还是存在一定的差距，而且我国在酶工业的生产上有很多问题，这种差距会随着国人的不懈努力而缩小，并且淀粉酶的发展也必定带动相关产业链的快速发展，而相关产业的发展也必将促进酶工业的进步。为了满足我国高速发展的生产需要，急需解决当前的不足，扩大淀粉酶制剂的品种和产量。由于淀粉酶是一种生物催化剂[11]，需要在特定的温度、pH等条件范围内才能正常进行反应。所以为了提高淀粉酶活性，保证较高的淀粉转化效果，对淀粉酶的反应条件的研究对于淀粉酶工业的发展具有重要的意义。当然筛选出高产淀粉酶菌株也同样重要。本文通过实验对实验室保存的一株产淀粉酶嗜热菌的淀粉酶最适反应条件及相关酶学性质进行研究。

　　2 材料与方法

　　2.1 仪器和材料

　　2.1.1 主要仪器

　　2.1.2 主要试剂

　　2.1.3 培养基

　　(1)固体培养基(g/100 mL)：蛋白胨 1，牛肉膏 0.3，可溶性淀粉 0.5，NaCl 0.5，琼脂 1.5，水 100 mL，将pH调节为7.0-7.2，121 ℃高压蒸汽灭菌20分钟。

　　(2)液体培养基(g/100 mL)：蛋白胨 1，牛肉膏 0.3，可溶性淀粉 1，NaCl 0.5， 水 100 mL，并将pH调节为7.0-7.2。121 ℃高压蒸汽灭菌20分钟。

　　2.2菌株的活化及保藏

　　2.2.1 菌株的活化

　　在超净工作台上用接种环将斜面保藏的已筛选出的产淀粉酶嗜热菌接种到固体培养基的平板上并用涂布器均匀涂布，静置5-10分钟，然后倒置于50 ℃的恒温培养箱中培养24 h[12]。24 h之后在平板培养基的表面滴加少量卢戈氏碘液[13]，若菌落的周围出现了无色透明的水解圈，说明淀粉被水解了，即该菌是产淀粉酶菌并且该菌已被活化[14]。

　　2.2.2 菌株的保藏

　　将已活化的产淀粉酶嗜热菌接种于斜面培养基上，放置于50 ℃的恒温培养箱中培养24 h，24 h后将长满菌苔的斜面培养基放在冰箱里保藏，以备后用。

　　2.3 淀粉酶活力的测定

　　2.3.1 麦芽糖标准曲线的制作

　　首先取7支20 ml带有刻度的试管,预先洁净后灭菌干燥，并按表1加入试剂后编号，震荡摇匀，然后在沸水浴中煮沸5 分钟后取出，可用水冷却至室温，最后加蒸馏水定容至20 ml，并以1号管作为空白对照调零,在波长为520nm下进行比色测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标作图，并建立回归方程。

　　表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值

　　2.3.2 粗酶活力测定

　　①待测粗酶液的制备：

　　在超净工作台上用接种环在固体培养基平板上将已活化的产淀粉酶嗜热菌接种到100 ml液体培养基中，作为种子培养液培养48 h。48 h后在超净工作台上将菌液转移到离心管中并用4000 r/min的转速对菌液离心20分钟，取上清液保存于25ml锥形瓶中备用，即为粗酶液。

　　②按以下顺序操作：

　　首先取预先洁净灭菌干燥的试管进行编号。然后在各只试管中依次加入粗酶液1 ml，与柠檬酸淀粉缓冲液同时在50℃水中预热5min，接着向各试管中依次加入柠檬酸淀粉缓冲液1ml，于50℃水浴中精确反应保温5min，最后向各试管依次加入3,5-二硝基水杨酸1.5 ml，在沸水浴中反应5 min，加入少量氢氧化钠溶液终止反应，流水冷却至室温后加蒸馏水定容至20 ml[15]。震荡摇匀，在波长为520 nm时用分光光度计测定吸光度值。在上述条件下以单位体积样品在30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位(MMU)表示酶活性。

　　在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力

　　酶活力测定公式：

　　淀粉酶活力=麦芽糖释放量(mg)·6·稀释倍数

　　2.4 粗酶特性初步研究

　　2.4.1 温度对酶活性影响的测定

　　温度对酶的活性有重要影响，是酶学性质的重要因素之一。在本次试验中，通过在不同温度下对产淀粉酶嗜热菌的淀粉酶活性进行测定，按如下步骤：(1)在超净工作台上用接种环在固体培养基平板上将已活化的产淀粉酶嗜热菌接种到100 ml液体培养基中，作为种子培养液培养48 h。48 h后在超净工作台上将菌液转移到离心管中并用4000 r/min的转速对菌液离心20分钟，取上清液保存于25ml锥形瓶中备用，即为粗酶液。(2)预设水浴锅的温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，备用。(3)首先取预先洁净灭菌干燥好的试管进行编号。然后在各只试管中添加1 ml粗酶液，与柠檬酸淀粉缓冲液同时在预先设定好的温度下水浴预热5分钟，接着依次向相对应的试管中加入柠檬酸淀粉缓冲液1ml，在预先设定好的温度下水浴中精确保温5分钟，最后向各试管依次加入3,5-二硝基水杨酸1.5 ml，在沸水浴中精确反应5分钟后,加入少量氢氧化钠溶液来终止反应，流水冷却至室温后加蒸馏水定容至20 ml。震荡摇匀，在520 nm的波长下用分光光度计测定吸光度值。在上述条件下以单位体积样品在30 分钟释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性(MMU)。根据公式计算各温度下淀粉酶活性并以最高酶活性为一作相对酶活图，根据所测定的结果确定该酶随温度的变化和最适温度。

　　2.4.2 酶活性最适pH的测定

　　pH同样是酶活性重要影响因素之一。酶活性的最高、最适和最低pH，是酶重要的特征。在本次实验中，通过不同pH值的条件下对产淀粉酶嗜热菌的淀粉酶活性进行测定按如下步骤进行：(1)在超净工作台上用接种环在固体培养基平板上将已活化的产淀粉酶嗜热菌接种到液体培养基中，用作种子培养液培养48 h。48 h后在超净工作台上将菌液转移到离心管中并用4000 r/min的转速对菌液离心20分钟，取上清液保存于25ml锥形瓶中备用，即为粗酶液。(2)配置1%的淀粉缓冲液，将淀粉缓冲液pH依次调节为3、4、5、6、6.5、7、8、9、10、11，做好标记以备后用。(3)首先取预先洁净灭菌干燥好的试管进行编号。然后在依次向每只试管中添加粗酶液1 ml，与预先配置好的不同pH值的淀粉缓冲液同时在45 ℃水浴中预热5分钟，接着依次向相对应的试管中添加预先配置好的不同pH值的淀粉缓冲液1ml，在45 ℃水浴中精确保温5分钟，最后向各试管依次加入3,5-二硝基水杨1.5 ml，在沸水浴中精确反应5 分钟，加入少量氢氧化钠溶液终止反应，用流水冷却至室温后加蒸馏水定容至20 ml。震荡摇匀,在波长为520 nm的条件下用分光光度计测定各试管的吸光度值。根据公式计算各pH淀粉缓冲液下的酶活性并以最高酶活性为一作相对酶活图，从而确定酶活力随pH的变化以及最适pH值。

　　2.4.3 金属离子对酶活性的影响

　　酶的反应体系中存在着许多离子，金属离子也是其中重要的一员，所以研究金属离子对酶的影响是我们调节酶活性的重要手段。取同浓度的不同的金属离子对已活化的产淀粉酶嗜热菌的淀粉酶活性进行测定。在本次的实验中，按如下步骤操作：(1)在超净工作台上用接种环在固体培养基平板上选取已活化的产淀粉酶嗜热菌接种到已经灭菌过的液体培养基中，作为种子培养液培养48 h。48 h后在超净工作台上将菌液转移到离心管中并用4000 r/min的转速对菌液离心20分钟，取上清液保存于25ml锥形瓶中备用，即为粗酶液。(2)配置100ml同浓度的Zn2+、Mg2+、K+、Fe2+、Cu2+的1%淀粉溶液，以备后用。(3)首先取预先洁净灭菌干燥号的试管进行编号。然后向各只试管中加入粗酶液1 ml，与预先配置好的各不同金属离子淀粉缓冲液同时在45℃水浴中预热5分钟，接着取预先配置好的各不同金属离子淀粉缓冲液1ml依次加入到对应试管中，于45 ℃水浴中精确保温5分钟，最后加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸，在沸水浴中煮沸5 分钟,加入氢氧化钠溶液终止反应，冷却至室温后加蒸馏水定容至20 ml。震荡摇匀，调节波长为520 nm后再分光光度计上测定各试管的吸光度值。根据公式计算各不同金属离子淀粉缓冲液下的酶活性并以对照酶活性为一作相对酶活图，从而确定不同金属离子对酶活性的影响。

　　2.4.4 茶碱对酶活性的影响

　　茶碱(Theophylline)是一种生物碱，与咖啡因可可碱一样具有显著的生理作用。广泛存在于茶叶、可可、咖啡等各种食品中。茶碱是一种甲基嘌呤类的药物，但过量服用会造成严重中毒。用不同浓度的茶碱对已活化的产淀粉酶嗜热菌的淀粉酶活性进行测定[16]。在本次的实验中，按如下步骤实施：(1)在超净工作台上用接种环在固体培养基平板上选取已活化的产淀粉酶嗜热菌接种到已经灭菌过的液体培养基中，作为种子培养液培养48 h。48 h后在超净工作台上将菌液转移到离心管中并用4000 r/min的转速对菌液离心20分钟，取上清液保存于25 ml锥形瓶中备用，即为粗酶液。(2)预先配置3 mmol/L、6 mmol/L、9 mmol/L、12 mmol/L、的1%淀粉缓冲液，以备后用(3)首先取预先洁净灭菌干燥好的试管进行编号。然后向各只试管中添加1ml粗酶液，同预先配置好的各不同浓度的茶碱淀粉缓冲液同时在45 ℃水浴中预热5分钟，接着取预先配置好的各不同浓度的茶碱淀粉缓冲液1 ml依次加入到对应试管中，在45 ℃水浴中精确保温5分钟最后加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸，在沸水浴煮沸5分钟，加入氢氧化钠溶液终止反应，冷却至室温加蒸馏水定容至20 ml。震荡摇匀，在波长为520 nm的条件下用分光光度计测定OD值。根据公式计算各不同浓度的茶碱淀粉缓冲液下的酶活性并以对照酶活性为一作相对酶活图，从而确定茶碱对酶活性的影响。