第1章 绪论
柑橘简介
柑橘(Citrus),科属芸香科柑桔属植物,是橘、柑、橙、柚、枳、枸橼、柠檬、藜檬等等水果的总称,起源于中国,培植栽种历史悠久,迄今为止,已有四千多年。柑橘是世界第一大水果,第三大国际贸易的农产品,在一百四十六个国家地区都有栽培,主要集中在中国、巴西、美国以及地中海沿岸的国家[4]。芳香味美,口感上佳,营养价值极高。含有丰富的糖类(葡萄糖、果糖、蔗糖等)、蛋白质、有机酸(柠檬酸)、矿物质、维生素(胡萝卜素、VC 、VP、VB1等)和多种人体必需氨基酸。而且果实具有药用价值,可以健胃、祛风、消炎、抗潰疡、抑菌、利胆扩张冠状动脉,增加冠状动脉血流量、降低患上肝癌、心脏疾病、中风和糖尿病的风险,还有抗癌作用等[5]。
柑橘主要损耗与保鲜
新鲜柑橘在采摘之后的运输贮藏等过程中,产生损耗的影响因素不胜枚举,其中包括:物理损害(机械损伤,恶劣的环境如温度过高或者温度过低)、生理作用(自身呼吸作用等产生的生理衰败)、微生物侵染(自带病原微生物以及外来病原微生物的侵染)及他们的交叉协同作用。
然而,柑橘最主要的损耗(破损、变质、腐烂)则是由于采后病害造成的。引起水果采后病害的主要病原菌[6]包括:灰霉病菌(Botrytis cinerea)、青霉菌(Penicillium)、链格孢菌(alternaria tenuis nees)、链生核盘菌(Sclerotinias clerotiorum)、镰刀菌(Fusarium roseum)等等。而这些病原菌除了小部分为疫霉菌(Phytophthora capsici)、炭疽菌(Colletotrichum)等寄生性能力很强的菌种外,大多数都是寄生性能力较弱的菌种及腐生性菌。而这些菌种想要导致柑橘发病、传染引发采后病害,都必须通过柑橘表面已经存在的物理损伤、虫噬等伤口侵入。
近年来,根据市场需求,科研人员对水果采后保鲜领域的研究迅速开展,研究出多种保鲜技术并应用于实际生产,主要包括:物化生三大类。物理技术主要有低温贮藏、低温气调贮藏、热处理、涂膜保鲜技术等几种常用的技术;化学技术主要包括化学杀菌剂、化学涂膜剂两大类,但是使用会势必会产生一定量的毒性和残留性,影响食品安全和生态环境。生物技术通常指使用拮抗微生物制剂或拮抗微生物制剂的代谢产物来抑制病原菌的侵染和繁殖,但是其繁殖、生长等较大的影响环境,且操作难度大,还在实际应用中缓慢发展。
柑橘采后主要病害
研究发现,我国柑橘采摘之后在贮藏、运输期间可能发生的采后病害可达至20余种[7],主要分为两大类。生理性病害:由恶劣的物理、化学等非生物环境因素直接或间接引起的植物病害,又称非侵染性病害,主要包括:油斑病、褐斑病、枯水病以及水肿病等。侵染性病害:由大多的致病性真菌等微生物侵染而引起的病害,主要包括由绿霉病菌(指状青霉,Penicillium.Digitatum)引起的绿霉病;由青霉病菌(意大利青霉,Penicillium.Italicum)引起的青霉病;由白地霉(Geotrichum candidum)引起的酸腐病(Oospora citriaurantii);由黑色地腐病菌(Diplodia namlensis evans)引起的黑色蒂腐病(Diplodia natalensis Evans);由柑橘囊孢壳菌(Diaporthe medusaea)引起的褐色蒂腐病(Phomopsis citri(Fawcett)Wolf);由柑橘球座菌(Phoma citricarpa)引起的黑斑病(Guignardia citricrpa Kiely);由寄生疫霉(Phytophthora parasitica)引起的褐腐病(Phytophthora citrophthora(R.et E.smith)Leonian);由柑橘链格孢(Alternanaria citri)引起的黑腐病(Alternaria citri Elliset Pierce)以及由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)炭疽病(Colletotrichum gloeosporioids(Penz.)sacc)等[6,8]。
其中,最严重的是柑橘绿霉病,近年来研究发现,,由指状青霉(Penicillium digitatum)侵染柑橘引起的绿霉病是最严重的柑橘采后病菌。最高可引起90%的采后腐烂损失[2]。而我国柑橘采后腐烂损失的80%是由绿霉病菌引起的[3],且此病原菌不容易被抑制,严重影响果实品质、商品价值、生态环境和人类身体健康。因此,长期以来,研究有效抑制柑橘绿霉病发生的方法,一直都是研究的热点和难点。
柑橘绿霉病菌
绿霉病的病原为指状青霉(Penicillium digitatum),菌丝体最适生长温度为25 ℃,致死温度为70 ℃,是菌物界无性型真菌门半知菌纲壳霉目杯霉科指状青霉属的菌种。绒状菌落,颜色开始为不明亮的黄绿色,逐渐变成橄榄灰色,嗅之,有特殊香味;分生孢子梗无色较短,顶端有一到两个分枝,枝大,且呈不规则的帚状;会在不同的高度上形成若干产孢瓶体;分生孢子为卵形至圆柱形。
绿霉病[9],在发病初期的柑橘表皮上,会出现一定程度的软化现象。褪色呈水渍状,轻轻一压,果皮很容易出现伤口。之后,其中央表层长出大量的气生菌丝体并聚集成白色霉状物,扩散成由菌丝组成的近圆形的白色霉斑。接着在霉斑围成的白色菌丝环中间会长出青色或绿色粉状物,即分生孢子梗和分生孢子。绿霉病发病迅速,数天内可扩展到整个果实。
双乙酸钠的性质和抑菌机理
双乙酸钠(Sodium(Hydrogen)Diacetate):又名双乙酸氢钠、二乙酸钠,简称SDA,是由短氢键缔合的乙酸钠和乙酸的分子复合化合物。双乙酸钠是一种白色吸湿性结晶性状粉末,熔点为96~97 ℃,加热至150 ℃以上分解,具有乙酸的挥发性气味,易吸湿,易溶于乙醇和水(1 g/mL),水溶液pH值为4.5至5.0。
双乙酸钠对真菌、霉菌、细菌等菌类都具有很强的抑制作用,其分子内的单分子乙酸与类脂化合物的相溶性较好,可以降低物质的pH值,因而可以透过细胞壁,有效地渗透进入菌类组织的细胞中,干扰细胞间酶的相互作用,促使菌体蛋白质的变性,且改变细胞形态和结构,达到菌体脱水死亡目的,起到抗菌防腐的作用。当既要求保持乙酸的杀菌性能,又要求因它的加入而不致于使产品酸性增强太多时,则不直接使用乙酸而使用双乙酸钠。与山梨酸等合用时,有较好的协同作用[10]。
双乙酸钠是霉菌和细菌的高效抑制剂,它可以高效抑制人类食用的肉类、蔬菜、水果、玉米、麦类、花生、 谷物、豆类、面包及其它农产品常见的10余种霉菌素(孢子)和4种细菌核素的发生、滋长和蔓延[10]。被美国食品和药品监督管理局定为安全物质,我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2920-86)规定:双乙酸钠可用于谷物和即食豆制食品,最大使用量为1 g/kg。
第2章 实验材料与方法
2.1 实验对象
柑橘指状青霉,分离自腐烂的柑橘果实的指状青霉(P.digitatum),现保存于湘潭大学生物与食品工程专业实验室[11]。
2.2 实验仪器设备
表1实验仪器一览表
设备名称 |
型号 |
产地 |
手提式压力蒸汽无菌器 |
MLS-3020 |
日本SANYO 电子有限公司 |
微机型电导率仪 |
DDS-W系列 |
上海般特仪器有限公司 |
微机型PH/mV 计 |
PHS-W系列 |
上海般特仪器有限公司 |
超净工作台 |
FLC-3 |
苏州安瑞净化公司 |
紫外分光光度计 |
UV-2450 |
日本SHIMADZU 公司 |
分析天平 |
FA1004N |
上海精密科学仪器厂 |
电子天平 |
BL320H |
日本SHIMADZU 公司 |
生化培养箱 |
SPX-250B-D |
上海博迅实业有限公司 |
海尔冰箱 |
BCD-202K |
青岛海尔股份有限公司 |
电热鼓风干燥箱 |
101-1AB型 |
上海雅荣生化设备仪器有限公司 |
微型涡旋混合仪 |
XW-80A |
荣华仪器制造有限公司 |
2.3 实验试剂
表2实验药品
产品名称 |
纯度 |
产地/厂家 |
双乙酸钠 |
95% |
天津市恒兴化学试剂制造有限公司 |
葡萄糖 |
分析纯(AR) |
天津市恒兴化学试剂制造有限公司 |
琼脂粉 |
分析纯(AR) |
天津市恒兴化学试剂制造有限公司 |
磷酸氢二钠 |
分析纯(AR) |
西陇化工股份有限公司 |
磷酸二氢钠 |
分析纯(AR) |
西陇化工股份有限公司 |
氯化钠 |
分析纯(AR) |
天津市恒兴化学试剂制造有限公司 |
胆固醇 |
生化试剂(BR) |
梯希爱(上海)化成工业发有限公司 |
香草醛 |
分析纯(AR) |
梯希爱(上海)化成工业发有限公司 |
乙醇 |
分析纯(AR) |
天津市风船化学试剂有限公司 |
磷酸 |
分析纯(AR) |
天津市风船化学试剂有限公司 |
甲醇 |
分析纯(AR) |
湖南师大化学试剂厂 |
氯仿 |
分析纯(AR) |
西陇化工股份有限公司 |
浓硫酸 |
分析纯(AR) |
西陇化工股份有限公司 |
2.4 培养基及其配制
马铃薯葡萄糖固体培养基[12](PDA培养基):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉20 g,蒸馏水1000 mL。将土豆去皮,称取所需量,削成薄片煮沸30 min,用四到八层纱布过滤,加入葡萄糖和琼脂粉,完全溶化后定容至1000 mL,自然pH。按实验需要分装,使用手提式高压蒸汽灭菌锅,121 ℃高压湿热灭菌30 min。
马铃薯葡萄糖液体培养基[13](PDB培养基):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1000 mL。将土豆去皮,称取所需量,削成薄片煮沸30 min,用四到八层纱布过滤,加入葡萄糖,溶化后定容至1000 mL,自然pH。按实验需要分装,使用手提式高压蒸汽灭菌锅,121 ℃高压湿热灭菌30 min。
2.5 实验方法
2.5.1 双乙酸钠对抑制指状青霉菌丝体生长的测定
采用琼脂稀释培养法[14]来研究双乙酸钠对指状青霉菌丝体生长的影响。取已经灭好菌的马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA培养基)60 mL,57 mL,54 mL冷却至60 ℃左右,在超净工作台中分别加入现配置的浓度为0.1 g/mL的双乙酸钠溶液0 mL,3 mL,6 mL,震荡均匀,使其最终组分浓度分别为0,0.5%,1.0%(w/w)即0,5,10(mg/mL)3种,对应加入培养基中,充分混合,开始倒平板。使每培养皿的总体积为20 mL。每个培养皿接入一个从培养7 d,长势均匀的培养基上用打孔器(d=6.0 mm)打下的生长一致的菌苔,于28±2 °C的恒温培养箱中倒置培养,2 d后十字交叉法测量菌落直径。每个浓度设置3次重复,标记组别,进行粗判断浓度范围。
若0.5%(w/w)浓度的菌丝体生长直径仍为6.0 mm,设计0.1 %至0.4%(w/w)四种浓度梯度;若0.5%(w/w)浓度的菌丝体生长直径明显大于6.0 mm,设计0.6%至0.9%(w/w)四种浓度梯度;若1.0%(w/w)浓度的菌丝体生长直径明显大于6.0 mm,则说明双乙酸钠对柑橘采后绿霉生长无明显影响,最大添加量亦不能对指状青霉菌丝体生长起到抑制作用,不做研究。操作同上,2 d后,以肉眼看不到任何菌丝体生长的最低浓度,作为双乙酸钠的最小抑菌浓度MIC,然后在这些没有生长的菌苔周围再打下一新的菌苔,移接到新的培养基上继续培养2 d,4 d后以肉眼看不到任何菌丝体生长的最低浓度,作为双乙酸钠的最小杀菌浓度MFC,十字交叉法测量菌落直径,每个浓度设置3次重复,标记组别,结果取平均值,计算抑菌率。
抑制率= [(C-T)/C]×100,C:对照菌落直径(mm),T:不同浓度条件下菌落直径(mm)。
2.5.2 双乙酸钠对指状青霉细胞胞外电导率的测定[15]
采用微机型电导率仪来测定双乙酸钠对指状青霉菌丝体胞外电导率的影响。将培养7 d长势均匀的指状青霉,用接种环挑取少许至加有玻璃珠的无菌水中,配成菌悬液,孢子数大约是105。取马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB培养基) 100 mL,用移液枪加入200 μL菌悬液,在25±2 ℃的恒温培养箱中,以160 r/min 的转速震荡培养48 h ,过滤或抽滤除去上清液,将菌丝体在0.05 M pH=7.2的磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中清洗三次,使之悬浮,配成菌悬液。过滤或抽滤收集菌丝体,用50 mL的离心管等量称取30份,每份标准1 g(实际操作0.8 g/份),对照组CK的15份加入0.9%(w/w)的生理盐水20 mL至40 mL(实际操作30 mL/份),使之悬浮。实验组T的15份加入用0.9%(w/w)的生理盐水配置的0.4%(w/w)的双乙酸钠溶液20 mL至40 mL(实际操作30 mL/份),使之悬浮。
用双乙酸钠的0、MIC和MFC浓度分别处理时间为0 min,30 min,60 min,90 min,120 min,每处理完,采用微机型电导仪测定其胞外电导率,研究菌丝体胞外离子的变化趋势,每一个浓度梯度设置三次重复,结果取平均值并记录数据,用0.9%(w/w)的生理盐水作对照。
2.5.3 双乙酸钠对指状青霉细胞胞外pH的测定[15]
采用微机型pH/mV计来测定双乙酸钠对指状青霉菌丝体胞外pH的影响。培养及处理方法等操作步骤如2.4.2,测定其胞外pH值,研究菌丝体胞外氢离子浓度指数的变化趋势,每一个浓度梯度设置三次重复测定,结果取平均值,并记录数据,用0.9%(w/w)的生理盐水作对照。
2.5.4 双乙酸钠对指状青霉菌丝体细胞核酸泄露的测定[16]
采用紫外分光光度计来测定双乙酸钠对指状青霉菌丝体核算泄露,细胞成分释放的影响。参照Paul等[17]的方法,培养及处理方法等操作步骤如2.4.2。用双乙酸钠的0、MIC和MFC浓度分别处理指状青霉菌丝体,处理时间分别为0 min,30 min,60 min,120 min,每处理完后,过滤或抽滤菌悬液样品,收集上清液,在紫外分光光度计260 nm下测量其吸光度吸收值。若数值大于0.8,用0.9%(w/w)的生理盐水进行二倍稀释[18]。测量核酸泄露,研究菌丝体细胞成分释放的变化趋势。每一个浓度梯度设置三次重复,结果取平均值,并记录数据,对照组用0.9%(w/w)的生理盐水进行校正。
2.5.5 双乙酸钠对指状青霉菌丝体脂质含量的测定[19]
胆固醇标准曲线的绘制[20]:用分析天平分别精确称取胆固醇标准样品:0.210 g,0.400 g,0.608 g,0.800 g和1.000 g,并将称取得每一份胆固醇标准样品分别溶解于100 mL的氯仿溶液中,配制成五份胆固醇标样溶液,浓度分别为2.10 mg/mL,4.00 mg/mL,6.08 mg/mL,8.00 mg/mL和10.2 mg/mL。以胆固醇标样溶液的浓度为X轴,以胆固醇标准样品在紫外分光光度计260 nm下的吸收度值为Y轴,建立标准曲线。
采用磷光体香草醛素法测定[20]。首先,配制磷光体香草醛素试剂:用分析天平精确称量0.600 g质量的香草醛试剂,加入10 mL的无水乙醇溶液,玻璃棒搅拌,使其充分溶解,并用蒸馏水定容到100 mL,再用磷酸溶液定容到500 mL,配制时最好在阴凉处快速进行,配好的试剂存放在棕色瓶中,在室温条件下避光保存。
培养及处理方法等操作步骤如2.4.2,用双乙酸钠的0、MIC和MFC浓度分别处理指状青霉菌丝体,处理时间分别为0 min,30 min,60 min,120 min,每一个浓度梯度设置三次重复,用蒸馏水作对照。
处理后用四层纱布过滤收集菌丝体,按组别分装,置于培养皿中在电热鼓风干燥箱中进行干燥,做好标记。充分干燥之后,用分析天平准确称量0.002 g干燥菌丝,在研钵中充分研磨后,加入1000 μL蒸馏水,继续研磨至均匀溶解。用移液枪吸取100 μL菌悬液于2 mL的试管中,加入甲醇、氯仿、蒸馏水各500 μL,置于微型涡旋混合仪上混合3 min,充分提取脂质。倒入离心管中,以4 ℃,12000 rpm 的转速充分离心3 min。用移液枪吸取100 μL的下层液相即被提取脂质于试管,加入200 μL的浓硫酸,沸水浴加热10 min,自然冷却至室温。加入3 mL磷光体香草醛素到实验组和空白组,第二次置于微型涡旋混合仪上混合3 min。然后将混合液放在室温下10 min。显色染料在520 nm波长处测定其吸光度。总脂质含量用胆固醇标准校正曲线测定,脂质含量以mg/g表示[21]。