1 前 言

　　水产动物在养殖过程中常常会因为氮、磷元素的过量引起水质变化而受到影响，监测水质与减少水体污染已成为养殖业可持续发展的重要研究对象。在水体富营养化方面，藻类等水生生物对磷更为敏感，因此监测磷含量并控制污染尤为重要。

　　1.1磷简介

　　1.1.1磷概述

　　在自然界中磷不仅在数­量上少于碳、氮、硫，而且在各种化合物中其价态也很少变化，所以磷的存在形式简单，其循环形式也不像碳、氮、硫那样复杂。自然界中的无机磷化合物常以正磷酸盐的形式存在;有机磷化合物常见的有己糖磷酸酯、三糖碳磷酸酯、卵磷脂、核苷酸和核酸。人工和合成的含磷化合物主要为含磷农药和洗涤剂。

　　在自然界中磷的数量虽然较少，其存在形式也较简单，但是磷是生物生长的必需元素之一。天然的有机磷化合物不仅是生物细胞的基本结构组成物质，而且在生物的遗传、能量代谢、能量储存和转移及物质运输中起到重要作用。

　　1.1.2自然界中磷的循环模式

　　正磷酸盐的水溶性与其所处环境的酸碱度直接相关，而且磷酸是微生物和其他类型自养生物的主要磷源。因此，自然界的磷循环不仅指各种含磷化合物的消耗和再生、有机磷化合在食物链网中的转移和重组过程，也包括可溶性磷和难溶性磷酸盐的相互转化过程。主要循环过程如图

　　反应①为P2O5水合形成磷酸盐的过程，为非生物反应;

　　反应②、③的变化方向与环境的pH值有关，在酸性条件下有利于磷酸盐的溶解，环境pH值的变化，部分与微生物的活动有关;

　　反应④磷酸盐的生物同化过程，参与的生物有植物、藻类和菌类微生物;

　　反应⑤为磷酸盐的生物分解代谢过程;

　　反应⑥为有机磷化合物生物同化过程;

　　反应⑦为生物死亡、解体过程;

　　反应⑧为有机磷化合物的人工合成过程;

　　反应⑨为有机磷化合物的生物分解氧化过程。H2O

P­2O5­­ ①H2O 水溶性磷酸盐 ②③ 非水溶性磷酸盐

　　④ ⑤ ⑨ ⑧

　　⑥

生物体 ⑦ 有机磷化合

　　1.1.3磷在水体中的状态和总磷

　　磷在自然界分布很广,与氧的化合能力较强 ,磷在水体中有不同的存在形态, 且各种形态间可相互转化。天然水和废水中，磷可分为正磷酸盐、聚合磷酸盐(简称聚合磷，包括焦磷酸盐、偏磷酸盐和多磷酸盐。)和有机磷三种主要的化学状态。磷的物理状态主要分为溶解态(包括胶体)、悬浮态两种，其中悬浮态磷(含无机态和有机态)大多存在于细菌和动植物残骸的碎屑中。溶解态磷以各种形态的正磷酸盐存在，如 PO43-，HPO42-，H2PO 4 ,可作为营养物质被藻类吸收 ，但这些盐溶解度小 , 在水中的浓度也较低 。聚合磷酸盐是合成洗涤剂中的重要助剂 , 在水中以 P 2O74- , P3O105 - , HP3 O92 - , CaP2 O72 -等形态存在 , 也可为藻类吸收 。可溶性有机磷酸物主要有葡萄糖-6-磷酸, 2-磷酸甘油酸 ,磷肌酸等。

　　总磷是水样经消解后将各种形态的磷转变成正磷酸盐后测定的结果，以每升水样含磷毫克数计量。目前评价水质的磷的指标是总磷。

　　1.2总磷与水体富营养化

　　所谓水体富营养化指的是水体中大量存在无机氮、磷化合物引起藻类和其它水生生物大量生长繁殖的现象，其中磷是最重要的因素，(磷含量大于0.0一0.02mg/l)大多藻类以过多的无机磷化合物为营养而大量生长;水中的有机磷化合物通过异养微生物的分解氧化作用也可转化为无机磷化合物被藻类利用，所以各种形式的含磷化合物大量进入水体后，就会引起水体富营养化。其后果是：

　　①造成藻类的大量繁殖, 不仅使水体色度和浊度增加，而且使耗氧量大大增加，造成缺氧而影响其他生物生长繁殖。

　　②沉于水底的死亡藻类的厌氧分解的过程中促使厌氧菌繁殖，加速消耗水体氧气。

　　综合上述作用, 富营养发生后, 将先引起水底有机物消耗速度超过其生长速度 , 处于腐化状态 ,并逐渐向上扩展 , 严重时可使水体完全变为腐化区，整个生物生存的环境将面临崩溃, 这种状况反馈到生物体上, 使得藻类 、 植物及水生物趋于死亡。

　　水体富营养化的形成机理：藻类在环境适宜下，通过光合作用发生反应合成自身物质，反应式如下：

　　106CO2+16NO3-+HPO42-+122H2O+18H++能量+微量元素→C106H263N16P+138O2

　　由反应式可以看出，在水体中的氮和磷(特别是磷)是藻类生长的主要条件。

　　1.4总磷对鱼塘水质的影响

　　1.4.1鱼塘养殖体系

　　一般的小型鱼塘，其主要是在人工扶持下形成的圈养体系，与自然生态体系存在很大差别，由于是人工投入饲料养殖，因此系统结构发生了一定改变。在鱼塘这个以产量为主要目的的体系中，一般养殖生物量大量增长，而生物多样性减少，从而造成系统生态金字塔畸形，因此水质也常常出现较大波动。定期监测水质状况在水产养殖方面尤为重要。

　　1.4.2鱼塘水中磷的来源

　　在投饵为主的人工养殖模式下, 水体中磷的主要来源是饲料、肥料及引水过程中带来的磷。一般养殖中, 饵料占磷总输入的50%左右, 肥料为磷总输入的 10%～ 20%。

　　1.4.3磷对鱼类的影响

　　磷是鱼类等水产动物必需的常量元素,由于养殖水体中磷的含量比较少, 且鱼类对水中磷的吸收能力很差,鱼类正常生长发育需要一定的磷含量，自然水体中的磷已不能满足需求,因此饲料中的磷是养殖鱼类最主要的磷源。水体中磷含量过低会影响到鱼体正常的生长发育从而影响产量,但是随着过量投饵和肥料，就会使磷含量过高，同时再加上排泄出的磷会促进水体中藻类的生长,从而加重水体污染，使鱼大量死亡。不同的鱼类对于磷的需求量不同，所以保证养殖水体磷含量的适宜，对促进鱼类正常生长提高鱼产量具有重要作用。

　　1.4.3磷对养殖水体的影响

　　磷是养殖水环境生态系统中物质循环的重要环节,养殖水体中磷多寡能促进或限制水产养殖生态系统中物质和能量的转化。 另外, 磷作为浮游植物生长的限制性营养元素之一, 其需要量比氮少, 但由于自然界中存在的含磷化合物, 溶解性及移动性比含氮化合物低得多, 补给数量及速度也比氮少得多, 所以磷对水体初级生产力的限制作用往往比氮更强。 对于养殖水体来说, 如何保持稳定的浮游植物群落结构和数量是对该系统进行人工调节以及提高鱼产量的重要内容和手段,所以了解养殖水体中磷的含量, 为保持养殖水体生态环境的相对稳定提供依据,促进水产养殖业的发展。

　　1.5监测鱼塘水中总磷的含量

　　1.5.1总磷测定的方法及进展

　　总磷的测定方法多种多样，从最初的分光光度法到现在的流动注射分析法(FIA)、等离子发射光谱法(ICP-AES)等，技术已经日渐成熟。对于传统的分光光度法来说，钼酸铵分光光度法最为常见，其原理：在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵、酒石酸锑氧钾反应，生成磷钼杂多酸，被抗坏血酸还原后变成蓝色络合物，于 700nm 比色定量。FIA 测定总磷以钼酸铵分光光度法为基础，采用在线过硫酸盐/紫外消解方法，生成的络合物于880nm 比色定量。ICP 则是利用氩等离子体产生的高温使试样完全分解形成激发态的原子和离子，由于激发态的原子和离子不稳定，外层电子会从激发态向低的能级跃迁，发射出特征谱线。由于光强度与待测元素浓度成正比，通过光栅等分光后，利用检测器检测总磷特定波长的强度就可以得到总磷浓度。

　　总磷是水体富营养化的限制性因子 ,其现行的手工分析方法速度太慢且容易产生偶然误差,不能全面及时地掌握湖泊的水质状况及其异常变化 ,必须实现水质在线自动连续监测 ,为控制湖泊的富营养化污染提供技术支持。【10】

　　1.5.2测量鱼塘总磷的目的与意义

　　为了更好的了解鱼塘水质的状况，其中以总磷为主的富营养化备受关注，监测水体中总磷的浓度，判断水体是否富营养及富营养的程度来采取相应的措施，及时发现水质状况并调节改善，有利于养殖产量的提高。

　　1.6微生物制剂在调节鱼塘水质中总磷的应用

　　微生物制剂又称益生菌，它是根据微生物对动物体及生活环境有益的原理，经过人工选种并大量培养加工，再重新应用到人体内或环境中发挥其优势作用的活菌制剂。他的特点是成本低、无毒副作用和不污染环境等优点，所以目前多应用于养殖水体的调节优化。改善水体的微生物主要有光和细菌、芽孢杆菌、硝化细菌等。沈越的研究表明，土著菌对控制富营养化水体具有良好效果。我国微生物制剂在水产养殖中的应用是从在畜牧养殖业微生物制剂应用基础上发展起来的。研究始于 20 世纪 90 年代初期，最早应用于水产养殖业的微生物制剂是光合细菌，主要用于调节水质，同时也在光合细菌的培养和扩增技术、干法和湿法保存技术及应用效果方面做了大量工作，在藻类的大量繁殖、降低水体的浊度、改善水体生态环境具有良好的效果。

　　2 材料与方法

　　2.1实验材料

　　2.2实验方法与步骤

　　本实验采用钼酸铵分光光度法测量鱼塘水中总磷的含量，总磷分析方法一般分为两步：第一步是用氧化剂(过硫酸钾)将水样中不同形态的磷转化成正磷酸盐，即消解;第二步是显色，分光测定吸光度计算正磷酸盐的含量，即总磷的含量。

　　2.2.1实验原理

　　水中的磷几乎都以磷酸盐的形式存在，水中的含磷化合物在过硫酸钾的作用下，转化成正磷酸盐，产生如下反应

　　K2S2O8+H2O→2KHSO4+1/2O2

　　在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵、酒石酸锑氧钾反应生成淡黄色磷钼杂多酸，

　　反应式：PO43+­­ +(NH4)2MoO4+H+→(NH4)3PO4‘12MoO2+NH4++H2O

　　加入还原剂抗坏血酸，磷钼杂多酸被还原成蓝色络合物，即磷钼蓝，此络合物在700nm波长下有最大吸收度，通过测出水样的吸光度，根据标准曲线即可算出浓度。 2.2.2样品采集及保存

　　从监测现场采集水样到实验室进行样品分析，一般需要若干小时，由于环境温度等因素的变化，水样在运输和保存期间会发生化学和生物等一系列变化，使水样发生变化，因此需要采取一些列措施加以保护。对于本实验的磷指标检测来说，由于磷容易吸附，所以不用塑料容器而需要保存在玻璃容器中。

　　水样保存方法分为物理法和化学法。物理方法即将水样放于冰箱冷藏，可以抑制微生物繁殖，减缓水样的生物化学反应和物理挥发。对于监测水样中的总磷来说，化学法为在水中加入硫酸调节酸碱度，使pH≤2，防止金属离子水解。由于水样不稳定，因此采样后应尽快分析，可以减少误差。需在24小时内测定。

　　2.2.3溶液配制

　　(1)(1+1)硫酸。取200ml浓硫酸缓缓加入200ml蒸馏水中并搅拌均匀。

　　(2)5%的过硫酸钾溶液：溶解5g过硫酸钾于水中，可水浴加热加快溶解，移入100ml容量瓶中稀释至标线。

　　(3)10%抗坏血酸溶液：溶解10g抗坏血酸于水中，移入100ml容量瓶中并稀释至标线。该溶液贮存在棕色玻璃瓶。由于抗坏血酸溶液不稳定，易被空气中的氧气氧化而变质，因此最好现配现用。

　　(4)钼酸盐溶液：溶解13g钼酸铵于100 ml水中，溶解0.35g酒石酸锑氧钾于100ml水中。在不断搅拌下，将钼酸铵溶液慢慢加到300ml(1+1)硫酸中，再加入酒石酸锑氧钾溶液并且混合均匀。此溶液贮存于棕色试剂瓶中，并放置在暗处。

　　(5)磷酸盐贮备溶液：将优级纯磷酸二氢钾于110℃干燥2h，在干燥器中放冷。称取0.217g溶于水，移入1000ml容量瓶中，加(1+1)硫酸5 ml，用水稀释至标线。此溶液每毫升含50.0ug磷(以P计)。本溶液在玻璃瓶中可贮存至少六个月。

　　(6)磷酸盐标准溶液：吸取10.00ml磷酸盐贮备液于250ml容量瓶中，用水稀释至标线。此溶液每毫升含2.00ug磷。临用时现配。

　　(7)5%稀硝酸溶液：5ml硝酸于100ml蒸馏水中。

　　2.2.4标准曲线绘制

　　(1)取7支50ml比色管分别加入0.0 ml，0.50 ml，1.00 ml，3.00 ml，5.00 ml，10.0 ml，15.0ml磷酸盐标准溶液，加水至25mL,然后加入4 ml过硫酸钾溶液消解。

　　(2)消解

　　过硫酸钾消解：将比色管的盖塞上后，用一小块纱布和线将玻璃塞扎紧(或用其他方法固定)，以免加热时玻璃塞冲出。将比色管放在大烧杯中，置于高压蒸汽消毒器或压力锅中加热，待锅内压力达1.1kg/cm2、相应温度为120℃时，保持30min后停止加热。待压力表指针降至零后，取出放冷，用水稀释至标线。

　　(3)显色

　　分别向各份消解液中加入1mL抗坏血酸溶液混匀，30s后加2mL钼酸盐溶液充分混匀，放置15min。

　　(4)测量

　　室温下放置15min后，使用光程为10mm或30mm比色皿，在700nm波长下，以水做参比，测定吸光度。从工作曲线上查得磷的含量。注：如显色时室温低于13℃，可在20～30℃水浴中显色15min即可。

　　2.2.4测定水样中的总磷含量

　　于50ml比色管中，取适量水样，加水至25ml,，再加入4ml过硫酸钾进行消解、显色、测量(过程如标准曲线一致)，测得水样吸光度后，依据标准曲线方程计算水样浓度。

　　2.3注意事项

　　(1)消解时应注意

　　1)使用时需加水(蒸馏水)到水位指示处，每次消解前都应该加水，并关紧放气阀和放水阀，防止缺水干烧。

　　2)消解过程中时刻注意压力表是否正常。

　　3)必需在压力表降到0MPa时且温度50度左右，才可以打开盖。

　　4)不可强制降温，否则会影响消解效果。

　　(2)配制过硫酸钾溶液时，难以溶解于水，可放置在45℃水浴锅加热促进溶解，不可直接加热或水浴温度高于50℃，否则将分解失效。

　　(3)配制钼酸铵溶液时，注意应将钼酸铵缓缓加入硫酸溶液中，如果操作相反将会导致显色不充分而影响结果。

　　(5)操作所用的所有玻璃器皿，使用前可用稀盐酸浸泡，用清水清洗后再用蒸馏水淋洗三遍即可，切不可用含磷洗涤剂洗刷。

　　(6)测量后用稀硝酸或铬酸浸泡比色皿片刻用以除去吸附的钼蓝显色物。