前  言

近几年感染性疾病在人类中发病率增高，病情愈加严重。其主要原因有：①化学疗法（如肿瘤的化学治疗）、免疫抑制疗法以及某种疾病（如艾滋病）降低了人类对真菌的抵抗力。②广谱抗微生物药的不合理使用破坏了正常人体内各种微生物之间的生态平衡，使真菌异常增殖而致病。③一般抗真菌药对真菌无效。真菌种类繁多，致病机制多样，其感染一般分为表浅部感染（浅部真菌病，superficial mycosis）和深部感染（全身性真菌病,systemic mycosis）[1] 。因此抗真菌药也常被分为抗深部真菌感染药和抗表浅部真菌感染药。

从上世纪30年代灰黄霉素被发现起，抗真菌药物的发展已经有70多年历史了。随着对真菌的认识不断加深和药物研究技术的快速发展，更多化学结构不同以及不同作用机制的抗真菌药出现。目前临床广泛应用的抗真菌药物按结构和作用机制不同分为（1）核苷类，包括灰黄霉素、5-氟胞嘧啶。（2）多烯类，主要有两性霉素B、制霉菌素。（3）氮唑类，又分为咪唑类和三唑类。咪唑类药物包括酮康唑、克霉唑、咪康唑、益康唑和舍他康唑等。三唑类包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和处于研究阶段的沙康唑、帕索康唑、雷夫康唑、SCH39304（SM8668）和SDZ89-485.（4）棘白素类，包括米卡芬净、卡泊芬净。（5）烯丙胺类，如特比萘芬。

伏立康唑（Voriconazole）是 Pfizer公司开发的新型广谱三唑类抗真菌药 ，为第2代三唑类抗真菌药物，口服和静脉给药均有效 且口服吸收利用度较高可达95%。其化学结构与氟康唑类似，属于氟康唑衍生物，是一种广谱的三唑类抗真菌药。伏立康唑与氟康唑、两性霉素B等抗真菌药物相比抗菌效力强，尤其对曲霉菌有较强的活性。主要用来治疗侵袭性曲霉菌、对氟康唑药效不明显的念珠菌引起的严重侵袭性感染及由足放线病菌属和镰刀菌属引起的严重感染。

伏立康唑的化学名称为:(2R,3S)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(5-氟基-4-嘧啶)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇 

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图1 伏立康唑结构式          图2 氟康唑结构式

伏立康唑属于氟康唑的衍生物 ,是在氟康唑化学结构丙基上加入1个甲基且用1个氟代嘧啶环替代了氟康唑中的1个三唑环[2] 。伏立康唑和氟康唑的结构式分别见图1、图2。伏立康唑对烟曲霉的细胞色素正常体P450依赖性羊毛甾醇-14a-去甲基化酶（三唑类药物的分子靶）的亲和力较氟康唑强。在氟康唑丙基骨架上加入1个甲基后，药物对靶酶的亲和力提升1个数量级，其IC 50（抑制50 % 酶活性所需药物浓度）由原来的4.8μmol /L变为0.48μmol /L。另外，氟代嘧啶环取代了氟康唑中的三唑环，使药物的抗真菌活性进一步提高。

伏立康唑抗菌机制 伏立康唑通过抑制真菌细胞色素P450（CYP450）依赖性羊毛甾醇-14a-去甲基化酶，从而抑制羊毛甾醇转化为麦角甾醇，导致构成真菌细胞膜的重要成分麦角甾醇的缺失。麦角甾醇缺失破坏了真菌细胞膜的完整性，从而导致细胞死亡[3]。

伏立康唑药动学 伏立康唑的组织渗透性、中枢神经系统的渗透性非常好。血浆蛋白结合率为58％，表观分布容积为4L/kg。伏立康唑口服给药成人生物利用度高达90%以上，而儿童只有66%左右，表明儿童的首过代谢高于成人。胃液pH的改变并不影响其吸收，但食用高脂肪食物后会降低伏立康唑的生物利用度。在多剂量给药直到稳态血药浓度后，组织药物浓度高于血浆浓度，脑脊液浓度低于脑组织浓度，为血浆浓度的50％左右。伏立康唑在儿童体内呈线性药动学特征，而在成年人体内则呈剂量依赖非线性药动学特征，从而导致成年人的给药异常复杂。其呈现非线性药动学的原因可能与负责清除药物的代谢酶的饱和性有关。Driscoll TA[15] 等研究发现，为达到成人推荐剂量(6 mg/kg 负荷剂量给药，4 mg/kg 维持剂量静脉注射，每12小时一次)的暴露量， 儿童必须以超过 7 mg/kg 的剂量给药。即儿童需给予更高的剂量才能达到与成年人体内类似的血药浓度[4] 。儿童和低龄青少年伏立康唑的清除率要明显高于成人。Walsh TJ  [4]等认为造成这一现象的原因是儿童肝脏质量与体重的比值相对于成人较高，或者受CYP2C19基因表达的影响。而外排转运体的活性和胃肠道药物代谢酶的差异则可能是导致其生物利用度低于成人的原因，伏立康唑的主要代谢途径是在肝脏中通过细胞色素P450的同工酶CYP2C19进行，代谢物静泌尿系统排泄，约有2％药物以原型随尿液排出[12]。

伏立康唑进行TDM(治疗药物监测)的必要性 伏立康唑主要在肝脏通过细胞色素CYP450的同工酶CYP2C19代谢酶代谢，只有少部分由其他P450酶代谢[5]。然而不同人种CYP2C19基因型有很大的差别，根据CYP2C19的基因型的不同， 可以将患者分为伏立康唑纯合子快代谢型、 杂合子快代谢型和纯合子慢代谢型。体内研究表明CYP2C19在本品的代谢中有重要作用，这种酶具有基因多态性，大部分的亚洲人属于弱代谢者，而白人和黑人中的弱代谢者仅占极小部分。在健康白人和健康日本人中的研究表明:弱代谢者的药物暴露量(AUCτ)平均比纯合子强代谢者的暴露量高4倍，杂合子强代谢者的药物暴露量比纯合子强代谢者高2倍。因此不同人种间伏立康唑代谢差异大。这是伏立康唑需要进行TDM的首个原因。其次不管注射给药还是口服给药， 在给予标准剂量的情况下伏立康唑在不同个体中也存在很大的药动学差异[6]。伏立康唑为酶抑制剂，很多药物可能与伏立康唑发生药物相互作用。抗结核药利福平和利福布汀、卡马西平、长效巴比妥类、苯妥英均为CYP酶诱导剂，可提高CYP酶活性。与伏立康唑合用时可降低伏立康唑血药浓度。抗艾滋病毒药物蛋白酶抑制剂（PIs）抑制伏立康唑代谢。他克莫司、环孢霉素、西罗莫司等免疫抑制剂容易引发侵入性真菌感染，合用伏立康唑时，伏立康唑体内药动学过程将会受到极大的影响[7]。不良反应的发生与其血药浓度升高有密切的关系。现有国外文献报道称伏立康唑的可能安全浓度范围为1～5.5mg/L [14] 。高血药浓度与视觉障碍(如,视觉改变、视力模糊、色觉改变、畏光),神经系统不良反应 (如:脑病、幻觉、外周神经病变、易焦虑),肝功能异常(如转氨酶升高、肝炎、黄疽)相关，而当血药浓度过低时则达不到治疗效果。综上几个原因伏立康唑进行TDM是十分必要的。

研究意义 首先，正如上文所述，伏立康唑的TDM是十分必要的。对伏立康唑进行血药浓度监测可及时调整用药剂量，优化个体给药方案从而减少不良反应以及提高疗效，对指导临床用药有极大的意义。再者，在国外有部分学者应用分子排阻色谱和柱切换技术对血浆中伏立康唑的浓度进行测定和使用质谱检测器进行检测，但由于实验成本高，操作繁琐，难以在临床上推广使用。生物分析法较HPLC简便易行且价格便宜,但相对耗时、灵敏度和特异性都较差,不适用于联合的抗真菌治疗[13]。相比较HPLC一 UV是最为常见且检测性能好的测定方法，更符合医院实验室条件。通过本实验研究找到适合本实验室自身条件的监测方法，更方便临床药师开展临床用药指导工作。

研究内容 本实验应用HPLC通过调整流动相的比例、选择合适的内标物、改善血浆处理方法找到合适的色谱条件测定伏立康唑血药浓度，从而指导临床用药。

给药方法 12岁以下患儿7mg/kg静脉滴注每12小时一次；12岁以上患儿采用负荷剂量给药，第一天6mg/kg静脉滴注每12小时一次，随后4mg/kg静脉滴注每12小时一次；或口服给药，当患儿体重＜40kg时，100mg每12小时一次，体重>40kg时，200mg每12小时一次[13]

本实验中7例患儿静脉注射伏立康唑（3.97～7.4）mg/kg，q12；2例患儿分别口服伏立康唑片100mg、200mg。

1、材料与方法

1.1、仪器

高效液相色谱仪戴安U-3000);医用低速离心机 (安徽中科中佳科学仪器有限公司 );旋涡混合器 (广州MS3 )。

1.2、试药

注射用伏立康唑（规格：0.1g，丽珠制药，批号: 160806）、伏立康唑标准品（纯度：98 .9 % ,中国生物制品检定所）、 酮康唑（纯度:99.0%，中国生物制品检定所）、乙腈（德国默克股份有限公司）、甲醇（德国默克股份有限公司）为色谱纯、三乙胺（江苏强盛功能化学股份有限公司）、冰醋酸（aladdin）为分析纯

1.3、方法

1.3.1、色谱条件

戴安U-3000DimonsilC18(4.6mm×250mm,5μm)为分析柱，乙腈：缓冲液（三乙胺：冰醋酸：水=5:5:490）为流动相，检测波长为255nm，柱温为40℃，流速为1mL/min，进样量20μL。

1.3.2、溶液的制备

（1）对照品溶液  精密称取伏立康唑25mg，用乙腈溶解，置于25mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀后得1000μg/mL对照品储备液，置4℃冰箱中冷藏备用。（2）内标溶液的配制  精密称取酮康唑2.5mg置25mL容量瓶中，以乙腈为溶剂定容至刻度，得100μg/L内标储备液，置4℃冰箱冷藏备用。

1.3.3、血浆采集

在患儿连续给药至少三天后，在下一次给药前30分钟收集血常规废弃标本，离心取上层血浆，4℃保存。

1.3.4、血浆处理

准确吸取患者血浆样品350uL，加内标溶液50uL，摇匀；加乙腈600μL，漩涡混合，放置2min,再以15000r/min离心15min，取上清液20μL进样分析。

2结果

2. 1色谱行为

在2.3.1项色谱条件下，空白血浆、空白血浆+伏立康唑、空白血浆+内标、空白血浆+伏立康唑+内标的高效液相色谱图分别为图A、B、C、D。

 

空白血浆高效液相色谱图A

 

空白血浆+伏立康唑高效液相色谱图B

 

空白血浆+内标高效液相色谱图C

 

空白血浆+伏立康唑+内标的高效液相色谱图D

图一、伏立康唑色谱图

可见，伏立康唑和酮康唑的保留时间分别为4.723和6.057 min左右，色谱峰分离良好，分离完全，空白血浆在伏立康唑和酮康唑出峰前后无杂质峰干扰。样品血浆伏立康唑和酮康唑的保留时间与对照品一致，峰形良好，出峰前后无干扰。

2. 2、线性关系的考察

取2mL的离心管6支，各加入空白血浆350μL。各试管分别依次加入50μL浓度为400μg/mL、200μg/mL 、100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL的伏立康唑标准液，加50μL酮康唑内标使浓度为20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL 、2.5μg/mL 、1.0μg/mL、0.5μg/mL，按照1.3项方法操作，记录色谱图。以伏立康唑峰面积与内标峰面积之比为Y轴， 伏立康唑浓度为X轴，进行线性回归分析, 回归方程Y=00.23X+0.032（r=0.9989）,血浆中伏立康唑在0.5μg/mL~20μg/mL线性关系良好,按信噪比3：1得最低检测限为0.03μg/mL，详见图二。

 

图二伏立康唑线性关系

2. 3、回收率试验

配制伏立康唑浓度为0.625μg/mL、5μg/mL 、10μg/mL的低、中、高3个浓度的血浆样品，每个浓度配制5份，按1.3.3项下方法操作，测得峰面积，根据当日标准曲线求得实测浓度，以实测浓度与理论浓度进行比较作为方法回收率。结果显示该法操作的回收率达95%以上，测定结果见表 1。

2. 4、精密度试验

配制伏立康唑浓度为0.625μg/mL、5μg/mL 、10μg/mL的低、中、高3个浓度的血浆样品，每个浓度配制5份，作为一批精密度样品，按1.3.3 项下方法操作，根据当日的标准曲线求得实测浓度，计算日内精密度;连续测定3 d，计算日间精密度。实验结果表明日内、日间精密度皆在5%以内，能够符合生物样品测定的要求，测定方法回收率大于90% ，测定结果见表1

表1 血浆中伏立康唑

回收率及日间和日内RSD的测定结果（n=5）

血药浓度 (µg/mL)	平均回收率（%）	RSD(%)
		日间	日内
0.625	96.77	0.134	3.705
5	100.60	1.975	4.464
10	102.31	3.466	1.472

2.5监测结果

从九名患儿采集的样品，按1.3.3项下方法操作，得出监测结果见表3

表3患儿伏立康唑血药浓度监测结果

年龄（岁）	性别	体重（Kg）	感染真菌	给药方法 q12 /mg	血药浓度（mg/L）
7.85	男	21.0	曲霉菌	85	0.82
7.75	男	25.2	隐球菌	100	0.38
13	男	57.9	近平滑假丝酵母菌	200	1.30
14.42	女	35.6	白色假丝酵母菌	200	4.90
1.67	男	18.7	念珠菌	77	0.15
11.25	男	34.7	念珠菌	140	2.20
3.17	女	12.5	隐球菌	90	0.08
2.83	男	12	念珠菌	70	0.55
9	女	27.4	隐球菌	100	0.47

3讨论

3.1色谱行为

由图一可知在2.3.1项色谱条件下伏立康唑和酮康唑的保留时间分别为4.72min、6.06min左右，色谱峰分离良好，分离完全。空白血浆在伏立康唑和酮康唑出峰前后无杂质峰干扰。样品血浆中伏立康唑和酮康唑出峰时间和对照品一致，峰形良好，出峰前后无干扰。色谱图见图一

3.2线性关系

由表一和图二可知伏立康唑在0.5~20μg/mL范围内线性关系良好，r=0.9989。日间和日内RSD均小于5%，能够满足生物样品测定的要求。回收率均在96%~103%之间。

监测的九组患儿中，其中有一组患儿血药浓度高于4mg/L，易引发不良反应。有六组患儿血药浓度低于1mg/L,治疗效果不佳，调整剂量后血药浓度均在治疗窗内。其余两组患儿血药浓度均在1-4mg/L治疗范围内。见表3

3.3血浆样品处理方法选择 

萃取一般根据化合物的极性，即是脂溶性大还是水溶性大来选择萃取剂。对于血浆样品的处理，文献中有固相萃取、液液萃取，高氯酸和三氟乙酸萃取等方法，可以单独使用也可以结合起来用，但操作相对繁琐。结合本实验室的具体情况，后采用乙腈沉淀蛋白。乙腈可以使水的介电常数降低，从而令表面水层的生物大分子脱水，互相凝聚析出。乙腈稀释比例较小，且基本对pH无影响。本实验初采用血浆：乙腈=1:1的比例，蛋白沉淀完全，但是容易浑浊。后采用血浆：乙腈=1:2，蛋白沉淀完全且保持稳定。本方法实验原理简单，经济易操作。

3.4内标选择

内际物要求在本样品中不存在，能够与样品中各组分完全分离且与待测物的保留时间接近，与待测物峰的大小相近且不与待测物中各组分起化学反应，很纯净且在贮存中稳定。内标物是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，选择内标物是很困难和费时的工作.最简单的方法是用相关物。它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质（如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等）、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。实验初因为伏立康唑是氟康唑的衍生物故采用氟康唑作为内标，但氟康唑和伏立康唑在实验条件下分离效果差。综合考虑后尝试用酮康唑作为内标，在本实验条件下，内标与伏立康唑分离效果好、稳定性好、专属性高，故采用酮康唑作为内标物质。

3.5色谱条件的选择  

流动相和检测波长的选择主要参考张华峰等及董平等[8,9，10 11]。伏立康唑在255nm处有最大吸收，在255nm波长条件下检测样本，出峰效果好，出峰处无干扰，故选255nm作为伏立康唑的检测波长。由于伏立康唑的化学结构中含有三唑环，吡啶环等碱性基团，因此在流动相中加入一定比例的三乙胺，一方面可以调节流动相的pH值，另一方面可以作为扫尾剂，防止色谱峰的拖尾，改善峰形。

3.6伏立康唑血药浓度监测结果分析

李沁岭血药谷浓度相对较高，怀疑与负荷剂量给药有关。该患儿使用注射用伏立康唑，年龄在12到16岁范围内，青少年用药剂量应同成人。使用负荷剂量给药，第一个24小时给药6mg/kg，q12,开始用药24小时后每日给药2次，每次4mg/kg。对安全性大的药物常采用“首剂加倍”可迅速达到稳态浓度，此给药方式称为负荷剂量（loading dose）给药法，在需要立即使血药浓度达到稳态 浓度而快速起效时采用。因为首次剂量加倍，所以与没有负荷剂量给药的患儿相比，伏立康唑使用量更大，血药浓度较高。

刘诗维案例中伏立康唑与质子泵抑制剂奥美拉唑合用，血药浓度与其他未合用患者无显著差异。质子泵抑制剂奥美拉唑是一种苯并咪唑类取代物，它对细胞色素P450的同工酶 CYP2C19有抑制作用，伏立康唑主要由CYP2C19代谢，奥美拉唑对酶的抑制作用使伏立康唑的代谢受到影响，导致血药浓度升高。不过，伏立康唑与奥美拉唑合用出现具有临床意义的药物相互作用的情况相对较少见。WOOD 等[16]研究了18名健康志愿者同时给予口服伏立康唑和奥美拉唑，给药方案为伏立康唑200毫克，每天两次和奥美拉唑40毫克，每天一次。结果伏立康唑的稳态血药浓度升高了40％，该稳态血药浓度的改变并不具有临床意义，故临床上仍推荐维持原剂量。但有另一项研究表明，在健康志愿者在应用奥美拉唑每天40毫克，连续使用10天的同时重复给予伏立康唑第一天400毫克，一天两次，然后连续7天服用200毫克，每天两次，则可使奥美拉唑的 AUC、cmax分别提高4倍和2倍。故临床上伏立康唑与奥美拉唑合用时我们建议后者剂量减半[17] 。

患者血药浓度均在5 mg/L以下，所表现的症状均可以用基础疾病解释，没有不良反应发生。FDA简报中提出，随着血药浓度升高，天冬氨酸氨基转移酶和门冬氨酸氨基转移酶均升高；Pascual[18]报道，当血药谷浓度大于5.5 mg/L时，有5名患者（占31%）出现头昏或幻觉，而低于此浓度则无此不良反应发生。近年来，有学者建议在伏立康唑给药1周后应监测患者血药谷浓度，用于在临床上以指导医生和药师调整给药方案，使伏立康唑血药浓度处于有效治疗范围内［20］。国外文献报道伏立康唑可能的安全浓度范围为 1～5.5 mg/L［19］，当血药浓度高于5.5mg/L时，肝功能受损、视觉改变等不良反应发生率升高；当血药浓度低于１mg/L 时则可能出现疗效不佳，甚至治疗失败［21］。结合以上资料说明伏立康唑不良反应的发生于血药浓度密切相关。

结  论

目前文献报道的监测血药浓度的方法有色谱学法、免疫学法、微生物学法。本实验结合自身实验室的条件采用高效液相法监测，通过不断调整色谱条件来寻找适合测定伏立康唑的血药浓度的方法。证明在本实验的色谱条件下，操作简单快速，结果准确，灵敏度高，稳定性好，适合现有的实验室条件。

另外，就本实验条件监测了9组患儿伏立康唑血药浓度。进一步佐证了质子泵抑制剂奥美拉唑与伏立康唑联用会使伏立康唑血药浓度升高，但临床上并不常见，还有不良反应的发生与血药浓度密切相关。