前言

　　随着人们生活水平的的提高及生活方式的改变糖尿病(DM)的发病率呈明显的上升趋势，而糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者最常见并最严重的并发症之一，也是晚期糖尿病患者致死的主要原因[1]。DN是DM常见的微血管并发症，但是由于其发病隐匿，早期无明显的症状和体征，容易造成漏诊。目前临床上常用的DN诊断指标为尿微量清蛋白排泄率，但其检测过程繁琐耗时且具有一定的局限性，因而没有得到临床的广泛推广。而当DN病人出现临床症状时，很多患者即已出现大量蛋白尿，此时即控制血糖也不免肾功能的损害，且严重者会导致肾功能衰竭，严重地威胁患者的生命安全。但对于常规肾功能检测指标指标如肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的敏感度不高，如当肾小球的率过滤下降到正常的50%时Cr才有明显的上升，因此极易被漏诊而延误治疗[2]，所以采取行之有效实验室检查对于DN的早发现、早诊断和早治疗就显得尤为重要。随着糖尿病肾病发病率的逐年升高，近年来医学界对糖尿病肾损伤的早期诊断越来越重视，对其检测指标和评价指标的研究也逐渐广泛起来[3]。目前检测早期糖尿病肾病的指标较多，主要有U-Alb、β2-MG、BUN 、Cr、CysC、Hcy、Lp(a)和RBP等[4]。

　　U-mAlb是目前公认且普遍采用的诊断早期糖尿病肾病的特异性指标。正常情况下几乎不通过肾小球滤过膜，因此尿液中mALB 水平较低。大量研究表明早期DN尿mALB水平比尿常规、肾功能常规检查敏感性更高，即使肾小球轻度损伤，尿mALB也会显著增加。但由于尿mAlb测定的干扰因素很多,如剧增运动、尿路感染、心功能不全、全身性感染等都会导致尿mAlb排泄率增多，继而影响其对糖尿病肾病的治疗和监测[5]。

　　β2-MG是有核细胞合成的一种单链多肽小分子蛋白。正常人体内β2-MG合成和释放基本不受年龄、性别和肌肉量等因素的影响，且只在肾脏分解和排泄，由于相对分子质量小且不与血浆蛋白结合，可自由经肾小球毛细血管壁滤过，99.9%被近曲小管重吸收并降解[6]。因此正常情况下β2-MG的排出是极微量的，其含量的测定不受外界因素的影响，对肾脏损伤的评估更为准确敏感[7]。

　　CysC是目前临床较为认同的对早期DN患者诊断灵敏度较高的实用指标之一。由于肾脏是清除循环中血清CysC唯一器官 ,所以当CysC自由通过肾小球进行滤过时能在近曲小管处被重新吸收并被降解 ,不再返回血液，且无肾小管分泌[8]。并且正常CysC产生速率恒定，不受年龄、性别、饮食、炎症、肿瘤、内分泌或免疫性疾病等因素的影响[9]，所以被认为是反映肾小球滤过率的较好指标。

　　Lp (a)被认为是一种独立脂蛋白，直接在肝脏合成,经多种途径代谢,在血清中的浓度一般认为由遗传决定,在个体中相对稳定,几乎不受饮食、年龄、性别等因素影响,男女间无显著差异[10]。有研究表明Lp (a)分子升高与糖尿病微血管病变有关，所以糖尿病肾病患者血清中Lp (a)水平在一定程度上能反映肾实质损害的进度,可作为肾病病变程度判断的一项有效指标[11]。

　　Hcy为含硫氨基酸类成分，是动脉硬化性心、脑血管疾病的独立危险因素[12]，因此Hcy 是一种可以反映血管是否损伤的一种氨基酸，有研究显示Hcy与糖尿病损伤及动脉粥样硬化均具有一定相关性，其值升高表明由于血管内皮损伤所导致的肾脏损伤病变[13]。又有研究表明Hcy是糖尿病肾病的危险因子，并为其独立的预测因素[12]。

　　RBP是一种由肝脏分泌的高分子蛋白复合物。当RBP与靶细胞表面的受体结合时复合物解离，游离的RBP由肾小球滤过，几乎全部由近端肾小管上皮细胞重吸收，仅有少量从尿中排出。当肾小球滤过功能和肾血流量降低时RBP蓄积，血RBP浓度升高，因此，测定血清RBP可以反映肾小球滤过功能[14]。有最新研究表明，2型糖尿病患者升高的血清RBP与慢性肾损害明显相关[15]。

　　本研究通过对血清CysC、、Hcy、Lp(a)、RBP、β2-MG联合检测对早期糖尿病肾病进行诊断，并与健康对照组进行比较，探讨其在早期糖尿病肾病诊断中的作用，以期为临床应用提供参考。

　　1.材料与方法

1

　　胱抑素C试剂盒(上海复星长征医学科学有限公司)

　　同型半胱氨酸试剂盒(浙江夸克生物有限公司)

　　脂蛋白(a)定量测定试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)

　　视黄醇结合蛋白测定试剂盒(北京九强生物技术股份有限公司)

　　β2-微球蛋白检测试剂盒(北京九强生物技术股份有限公司)

　　尿微量白蛋白测定试剂盒(北京九强生物技术股份有限公司)

1

　　所有检测项目均采用Beckman Coulter AU系列全自动生化分析仪奥林巴斯AU5821

1.3实验方法

1

研究对象

　　选择湖南省人民医院2015年6月至2016年3月收治的住院的2型糖尿病患者196例作为研究对象，其中男患者100例，女患者96例，所有患者年龄45-70岁在之间，平均年龄(56.27±7.12)岁，入选病例均符合1999年WHO糖尿病的诊断标准[4] ,排除有高血压、原发性肾脏疾病、肝损伤、恶性肿瘤、各种糖尿病合并严重感染或急性并发症及药物毒性导致的肾脏疾病患者[5]。

　　1.3.2分组标准

 

按 UAER 水平将糖尿病患者分为单纯糖尿病组 (UAER<30 mg/24 h)33例、早期糖尿病肾病组 (UAER 30-300mg/24 h)34 例及临床糖尿病肾病组 (UAER>300 mg/24 h)29例，同时随机选取30例 同期OGTT结果正常的健康体检者作为对照组, 男女各15例, 平均年龄(54.31±3.34)岁。各组研究对象年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。

　　1.3.3样品收集与处理

　　所有受检者均经禁食12h后于清晨采集空腹肘静脉血4ml，3000r/min 离心10min，留取血清测CysC、Hcy、Lp(α)、RBP、β2-MG;收集24尿液，取10 ml，3000r/min 离心5min，取上清液检测U-Alb。

　　1.3.4 检测方法和原理

　　CysC和u-mAlb采用免疫比浊法：将血(尿)标本加入含有抗人血清白蛋白抗体的缓冲液中，如血(尿)中含有白蛋白，则会发生抗原抗体反应使溶液变浊，浊度的高低(340nm比色)与血(尿)中白蛋白含量正相关，以不同浓度的标准白蛋白依上述方法做标准曲线，结果可以从标准曲线上查得。

　　Hcy采用酶循环法：在TCEP作用下，氧化型Hcy转化为游离型Hcy，与共价底物SAM催化反应形成甲硫氨酸和s一腺苷同型半胱氨酸(ASH)，ASH被ASHase水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循环加入反应，从而放大检测信号，腺苷立即水解为次黄嘌呤和氨，氨在GDH的作用下使NADH水解为NAD，通过测定NADH变化速率得出标本中Hcy的浓度。

　　Lp(a)采用粒子增强免疫比浊法：待测样本中的Lp(a)与包被于聚苯乙烯粒子上抗-Lp(a)抗体发生特异性的抗原抗体反应，使聚苯乙烯粒子发生凝集。该凝集反应的吸光度变化与样品中脂蛋白(a)的浓度成一定的比例关系。用已知浓度的校准品制作校准曲线，从该曲线上求得样本中的Lp(a)的浓度。

　　RBP采用胶乳免疫比浊法：胶乳颗粒包被多克隆抗人RBP抗体与样本中的RBP抗原结合，在570nm检测其浊度的变化，其变化程度与样本中的RBP含量成正比。

　　β2-MG采用胶乳增强免疫比浊法：样本中的BMG与超敏化的抗体胶乳颗粒试剂反应形成免疫复合物，在波长572nm处检测其吸光度的变化。

　　实验前分别先使用配套的定标液及质控品对仪器进行校准及质量控制，再对各项指标的含量进行测定。本研究中正常值参考范围：CysC：0.51～1.09mg/L、Hcy：0～15umol/L、Lp(a)：0～300.0mg/L、RBP：20.0～75.0mg/L、β2-MG：1.0～3.0mg/L、u-mALB:5.0～25.0mg/dL。

1

采用SPSS17.0统计学软件进行数据处理和统计学分析，计量资料以均数± 标准差()表示，组间比较采用t检验;计数资料以率(%) 表示 , 采用χ2检验。以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

2. 1

4组5项指标比较　糖尿病各组CysC、Hcy、Lp(a)、RBP、β2-MG水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),糖尿病各组间各指标水平比较 ,早期糖尿病肾病组高于单纯糖尿病组 , 临床糖尿病肾病组高于早期糖尿病肾病组 , 差异均具有统计学意义(P<0.05)。详见表 1。

表1四组CysC、Hcy、Lp(a)、RBP、β2-MG、U-Alb水平比较()

组别	例数	CysC	Hcy	Lp(a)	RBP	β2-MG
NC SDM EDN CDN	60 66 72 58	0.68±0.26 0.82±0.37a 1.08±0.35ab 1.32±0.46abc	7.02±3.43 11.19±4.06a 15.46±5.52ab 19.68±8.10abc	89.77±54.71 202.94±85.20a 294.61±98.37ab 497.40±171.51abc	27.44±7.91 38.99±8.95a 46.09±13.86ab 53.38±12.18abc	0 2.18±0.44a 2.48±0.47ab 3.24±0.90abc

　　注：a:与NC组比较P<0.05;b:与SDM组比较P<0.05;c:与EDM组比较P<0.05。

2. 2

糖尿病各组与对照组血清CysC、Hcy、Lp(a)、RBP、β2-MG阳性率比较　将 Cys C>1.09mg/L,Hcy>15 mmol/L,Lp(a)>300mg/L,RBP>65mg/L,β2-MG>3mg/L视为阳性。糖尿病各组四项指标阳性率均明显高于对照组，具有显著性差异(P<0.05)。详见表 2。

　　表2四组CysC、Hcy、Lp(a)、RBP、β2-MG阳性率比较[n(%)]

组别	例数	CysC	Hcy	Lp(a)	RBP	β2-MG
NC SDM EDN CDN	60 66 72 58	0(0) 10(15.2)a 36(50)ab 34(58.6)abc	0(0) 18(27.3)a 36(50)ab 34(58.6)abc	0(0) 22(33.)a 42(58.3)ab 39(67.3)abc	0(0) 0(0)a 39(54.2)ab 36(62.1)abc	0(0) 12(18.2)a 40(55.6)ab 38(65.5)abc

　　注：a:与NC组比较P<0.05;b:与SDM组比较P<0.05;c:与EDM组比较P<0.05。

2.

早期糖尿病肾病组单项与联合检测阳性率比较　早期糖尿病肾病组共有72例,各指标单独检测阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)，5项联合检测阳性率明显高于单项检测 ,差异具有统计学意义 (P<0.05)。详见表 3。

　　表3EDN组单项和联合检测阳性率比较(n,%)

编号	项目	各组例数	阳性例数	阳性率
1 2 3 4 5 6 7 8	CysC Hcy Lp(a) RBP β2-MG CysC+Hcy+RBP CysC+Hcy+Lp(a)+RBP CysC+Hcy+Lp(a)+RBP+β2-MG	72 72 72 72 72 72 72 72	36 36 42 39 40 51 58 65	50 50 58.3 54.2 55.6 70.8a 80.6ab 90.3abc

　　注：a:与各单项检测比较P<0.05，b:与6号比较P<0.05，c:与7号比较P<0.05。

　　3讨论

　　Cys-C 是一种非糖基化小分子碱性蛋白质，生成速度稳定，生成后可以被肾小球完全过滤，然后在近曲小管重吸收和降解，在整个过程中不会受到炎症反应、肿瘤、溶血、感染或免疫和内分泌疾病等的影响。但当患者发生肾小球损伤时，血清的 CysC 水平会明显升高[16]。因此Cys-C 是反映肾小球滤过率的的良好标志物[17]。

　　Hcy主要在肾脏合成与代谢，当肾小球滤过功能降低或肾小管代谢功能受损时血清Hcy水平增高，从而影响肾脏内皮细胞及肾小球基底膜细胞的功能。国外有研究表明，高 Hcy 水平会对血管内细胞造成损伤，并对血小板的聚集和黏附功能造成损害，最终引发肾小球的损伤[18]。通过使肾小球滤过膜孔径增大，压力增高，最终导致滤过功能失常，继而使血清Hcy水平进一步增高，形成恶性循环[19]。

　　RBP作为一种高分子蛋白，正常代谢过程中几乎全部由近端肾小管上皮细胞重吸收，仅有少量从尿中排出。而肾小球滤过功能受损和肾血流量降低时,血中各种形式的 RBP无法通过肾脏排泄,导致血中 RBP 浓度升高,因此,当肾小球滤过功能受损时 ,血清中的 RBP 浓度水平明显升高[20]，由此可知，肾小球滤过功能直接影响血清RBP水平。

　　Lp (a)作为LDL的特殊类型,可促进肾小球硬化。Lp (a)还可通过刺激肾小球增殖、肥大,细胞外基质堆积,从而使肾小球血流量减少,加重肾损害[21]。所以糖尿病肾病患者血清中Lp (a)水平在一定程度上能反映肾实质损害的进度,可作为肾病病变程度判断的一项有效指标[22]。又有研究认为血清Lp (a)水平的增高与糖尿病肾病的发生、发展关系密切,有可能是其始发因素之一,并且与肾脏损害程度呈正相关[11]。

　　在排除自身免疫性疾病、慢性肝炎、恶性肿瘤等造成机体自身合成大量β2-MG的疾病外，血清β2-MG水平上升反映肾小球滤过率下降，而尿β2-MG水平增加提示肾小管功能受损，因此可作为评价肾小管功能受损的敏感指标，还可以反映肾小管受损的严重程度[23]。而由于尿液的酸性环境中容易被分解，因此尿液中β2-MG测量结果的准确性受到影响[24]，因此测定血清β2-MG能更准确反映肾损伤。

　　近年来有研究人员报道了通过检测Hcy、CysC、hs-CRP、HbA1C、RBP水平来对糖尿病早期肾损伤进行诊断，发现血清 Cys-C、Hcy、RBP与UAER均有较好的相关性，为其提供了一定的临床依据[25]本次研究结果表明，血清 Cys-C、Hcy、RBP水平随糖尿病肾病病情的逐渐加重而越来越高，与上述结果相吻合，且均高于正常体检者，三者联合检测阳性率明显高于单项检测。同时本研究再联合Lp(a)发现阳性率比三者的更高，且随着糖尿病肾病病情的发展，呈上升趋势，故其临床价值得以验证。有研究[26]显示：单纯糖尿病组、糖尿病肾病早期组和临床糖尿病肾病组，β2-MG呈明显上升趋势，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，说明随肾小球损伤加重，血清 β2-MG 也逐渐升高。此研究同本研究结果一致。3项联合、4项联合与5项联合的阳性率与单项比较差异有统计学意义(P<0.05),4项联合与5项联合的阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，分别为80.6%和90.3%，5项联合的阳性率比4项高了近10%，因此本研究联合五项指标对早期糖尿病肾损伤的病人检测的阳性率更高，这将会进一步提高检测的灵敏度，有助于早期、准确地判断肾脏损伤，有助于疾病尽早发现并得到治疗。

　　4小结

　　综上所述，在诊断肾脏损伤时，一定要结合临床综合分析，将血清CysC、Hcy、Lp(a)、RBP及β2-MG联合检测，大大提高了检测的阳性率，即减小了漏诊率，为病人早治疗早康复提供依据。