第一章：文献综述
四氢呋喃（tetrahydrofuran, THF），又名氧杂环戊烷、一氧五环、1,4-环氧丁烷、二乙烯化氧、四甲烯化氧或四甲撑氧等，是一种饱和环醚，也是最强的极性醚类化合物之一，常温下为无色透明液体，带有类似丙酮或乙醚刺激性气味，是一种人工化合物，其分子式为C4H8O，分子量72.11，CAS号为109-99-9，其化学结构式和主要的物理化学性质如图1-1和表1-1所示。
图1-1 THF化学结构式
Fig.1-1 Chemical structure of THF
表1-1 THF的物理化学性质
Table 1-1 Chemical and physical properties of THF
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参数 |
性质 |
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外观形态与气味 |
无色透明液体，带醚味 |
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分子式 |
C4H8O |
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分子量 |
72.11 |
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凝固点 |
-108.5℃ |
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沸点 |
66℃ |
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闪点 |
-20℃ |
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相对密度（水=1） |
0.8892 |
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蒸汽压 |
47.989 mmHg@0℃ |
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114.38 mmHg@15℃ |
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129.64 mmHg@25℃ |
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自燃温度 |
230℃ |
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溶解性 |
与水容易比混溶，溶于乙醇、乙醚、脂肪烃、芳香烃、氯化烃、丙酮、苯等有机溶剂 |
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爆炸极限 |
1.5~12.4%（体积） |
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危险品分类 |
3类（易燃液体） |
从THF的分子结构中可以看出氧原子是与碳原子相连而不是与氢原子相连，所以不能形成氢键，因此THF的沸点与密度均低于相应的醇类。因C-O键的键能大于C-C键的键能，THF分子结构比较稳定，很难断裂。但THF易燃、易挥发，蒸汽进入大气层后可通过与羟基、硝酸根自由基等光化学产物反应而被降解，而这两种反应的半衰期分别为1天和3天[1]。THF本身属于易燃物质，与空气混合会生成一些易爆性的过氧化物，遇明火、高热极易引起燃烧爆炸。在加压的条件下能够与氯化氢反应生成1,4-二氯丁烷。此外,因为其蒸气密度比空气重,低空下极易扩散，遇火源会引着回燃。若遇高热,容器内压增大,有开裂和爆炸的危险，燃烧时会生成CO和CO2产物，与氧化剂、强酸和强碱均能发生强烈反应[2]。
四氢呋喃的性质比较稳定，能溶解许多有机和无机化合物，并且其沸点低、流动性好、毒性比较小，常作为一种重要的有机合成原料和性能优良的溶剂，在精细石油化工中具有广泛的应用前景和开发价值。由于THF拥有特殊的理化性质，因此，在很早以前就被人类生活生产所应用和开发，在2001年世界THF的产量就已经达到了30.0万t[2]相关数据统计显示，到2006年底，全球THF生产量已经达到了接近65.0万t，消费量达48.0万t，并且现在正在以每年5.6%的速度增长[3],目前，世界上THF的生产能力已达500kt/a[4]，美国是THF的生产和消费大国。
在国内THF的开发和应用相对较晚一些，相关的技术发展水平有限，因而生产能力相对较弱，但是由于THF是一种优良的有机溶剂，对许多化学物质具有很强的溶解性，能够很好的扩散渗透到树脂的表面和内部，因而被广泛应用于石油化工生产中。作为一种反应性溶剂，THF能溶解除聚乙烯、聚丙烯及氟树脂以外的大部分化合物，特别是对聚氯乙烯、聚偏氯乙烯和丁苯胺有良好的溶解作用，被称为万能溶剂。被广泛应用于合成树脂和然树脂加工、聚氯乙烯管材加工。另外，聚氯乙烯屋顶涂料、聚氯乙烯薄膜涂料、磁带涂层、PVC表面涂层、清洗PVC反应器、脱除PVC薄膜、玻璃纸涂层、塑料印刷油墨、热塑性聚氨酯涂层和人造革的表面处理等生产中也有运用[5-7]。THF不但可以作为有机化合物溶剂，也可以作为无机化合物溶剂应用于氢化铝和氢化硼、芳基碱金属化合物和烷基碱金属化合物、甾族化合物和大分子有机聚合物等合成反应[8-10]，此外，THF还可用作高能材料、乙炔抽提溶剂、电镀涂层液、高分子材料光稳定剂等。
THF作为一种重要的有机合成原料也被广泛应用于生产l,4-二氯乙烷、四氢噻吩，戊内酯、2,3-二氯四氢呋喃、γ-丁内酯和吡咯烷酮等化工产品[6, 11, 12]；也可以发生聚合反应聚合生成聚四氢呋喃（PTHF），以取代二苯基甲烷二异氰酸脂（Diphenyl methane diisocanate，MDI）及其同系物用于生产聚氨酯合成革；或在一定压力和温度下与CO反应生成己二酸，己二酸合成己二胺，最后生成常用的尼龙66，给日常生产生活带来很多的便利；THF还可与1,4-丁二醇缩聚生成聚四氢呋喃醚（Polyoxytetramethylene glycol，PTIvlG），进而缩聚生成的聚四亚甲基醚二醇（Polyoxytetramethylene ether glycol，PTMEG），亦称四氢呋喃均聚醚。PTMEG可用于生产聚氨酯弹性体、氨纶纤维、特种橡胶和一些具有特殊用途的涂料；其中氨纶纤维是备受人类关注的合成纤维，在国际上有“第二皮肤”之称，其弹性强，柔软性好，广泛应用于内衣裤、运动服、泳装、紧身衣裤的领口和袖口等衣物的生产。在我国，THF主要应用于医药生产当中，常用于生产抗感染类药和激素类药，主要品种有头孢噻肟钠、琥乙红霉素、地塞米松磷酸钠、咳必清、黄体酮、利复霉素等。此外，由于其具有良好的挥发性能，在精密磁带工业和粘合剂生产方面也有所应用[13]。
随着THF在工艺生产中的不断应用以及其他的化工产品中THF作为中间产物的研究和开发，THF在自然环境中的含量有所增加，对大气环境造成了一定的污染，但是污染并没有造成严重的危害，从而并没有引起世界各国的重视和关注。然而，在各国重点控制的有毒有机物种类中只有德国把THF列于环境优先污染物“黑名单”中。
近年来，THF应用范围逐渐增大，使用量也随之增大，在合成化工生产中大量残留的THF常以废水、废气的方式排入环境中的量也不断增加。有研究报道，在1988年，大量的THF在美国加州的硅谷上空也检测出来了[14]。美国地下水和地表饮用水中都有检测到THF的存在，且地下水中的浓度超过了各个州设定的水质标准和准则（50-1300 μg/L）[15]。1999年，有报道称：在加拿大安大略湖的格洛斯特（Gloucester）填埋场里检测到THF污染[16]。据报道，李海燕等[17]在我国某饮用地表水也发现存在THF的污染。
随着THF使用量和生产量的逐年增加，再加上THF具有很小的亨利定律常数、低阻滞因数、高水溶解性和辛醇-水分配系数等特性，排放的THF经过长时间的积累则必然给生态环境造成严重的污染。
虽然THF被认为是一种低毒性的有机化合物，但是由于THF的广泛使用，日积月累之后，环境中的THF含量也逐渐增加，人体和其他生物长时间直接或间接接触到或暴露在THF中，也会受到不同程度的危害。因此，THF的毒理特性研究被国内外相关学者关注，且于1998年，美国相关研究部门正式将THF列为考察研究的对象[18]，开始对THF的毒理特性、致病性、致畸性、致突变性等方面进行研究。
THF属于环醚类化合物，具有一定的毒性，对人体的危害主要是经呼吸道、消化道、皮肤等途径侵入人体。接触低浓度的THF对皮肤和黏膜有一定的刺激作用；高浓度时有麻醉作用、对肝脏有毒性，严重时可能有致死作用，麻醉浓度与致死浓度基本相似。急性毒理学研究表明：大鼠经口LD50为1650 mg/kg，吸入LC50为21000 mg/m3/3h；小鼠吸入LC50为24000 mg/m3/2h，属于一种相对低毒的有机溶剂[19]。在高浓度下，THF会引起生物体的共济失调和昏迷[4, 20]。当THF的浓度为590mg/m3时，对大鼠的眼睑、鼻黏膜具有轻度的刺激作用，产生发红的症状；当THF的浓度大于14775mg/m3时，大鼠的角膜水肿和混浊，并伴有流涎、流涕和鼻出血等症状[21]。猫、兔、豚鼠及大鼠在50mg/L浓度下接触3h，导致部分动物四肢无力而发生侧倒；100mg/L下出现深度麻痹，部分动物在此浓度下暴露1-4.5h后致死；200mg/L下1h即出现麻痹，如长时间作用，可引起死亡。浓度在100到5000mg/L之间能造成小鼠中枢神经系统受到抑制[22, 23]。大鼠吸入浓度大于14000mg/m3，则出现睡眠，强直，抽搐等症状，随后进入深昏迷，并有癫痫样脑电波。动物一次接触高剂量或反复接触，会导致肝脂肪浸润以及细胞溶解。亚慢性毒性试验发现，THF吸入浓度为2360mg/m3时，每天4h，每周5d，共3周，可抑制小鼠的正常活动，而吸入浓度为590mg/m3时，对小鼠的正常活动影响不明显[22, 24-28]。动物反复吸入或间歇性暴露于低浓度THF的环境下，对其也会出现一定的耐受性。致癌性研究则充分表明THF对肝脏具有一定的毒性甚至有致癌性，此外也能使肾小管肿瘤和癌症的患病率提高[25, 28]，环境中THF的大量存在给人类健康带来极大的危害，因此，研究THF的毒理效应还是很有必要的。
THF和环境中其他的污染物最终的归宿是一样的，进入环境这个大的生态圈中后，都会受到环境中不同环境因子（光照、温度、生物、非生物物质等）的影响，大致可经过光分解、化学分解与生物降解三种方式进行不同程度的分解，而这三种分解作用经常会交织在一起发生作用。但是由于THF的环醚结构及C-O（360 kJ/mol）的高能键，其曾一直被认为是“不易生物降解物质”[29, 30]。因此，最初去除THF污染物的研究主要集中在传统的物理和化学处理方法。随着科学技术的发展和生物技术研究的提高，THF的高效降解菌的不断发掘和研究，THF的生物降解研究越来越受到相关科研人员的重视和青睐。
在化工、医药、纺织等生产中THF一般作为有机溶剂用于溶解有机物，并不是直接参与反应。在实际的生产应用中，THF主要以废液的形式排放，因其中含有杂质而不能被直接再利用。THF通常是同水和其它有机溶剂共存于液相中，用普通的物理方法难以分离，这样不仅造成了资源的浪费又对环境造成了污染。常压下，THF可与水形成最低恒沸物，恒沸温度64℃，利用普通的蒸馏法无法分离得到高纯度的THF。目前，分离恒沸混合物或组分挥发度相近的液体混合物的有效方法是萃取精馏法。通常是在被分离的混合物中加入另一种专门选择的特殊组分（或称为萃取剂），常为一种较难挥发的物质。这方面的研究比较多，何志成等[31]选取二甲苯作为THF的萃取剂，以液-液萃取、氧化、间歇精馏等技术，从THF、水、甲醇和乙醇四元混合物体系中分离出来的THF，其纯度超过98%，回收率超过58%。张光旭等[32, 33]提出以1,4-丁二醇为萃取剂对THF-水恒沸物进行萃取精馏，THF的纯度可达到99.9%。陈昀等[34]采用常压间歇精馏法将副产物THF-水恒沸物中THF浓度提高到94.4%。叶秀丝等[35]以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为萃取剂利用间歇萃取精馏分离技术,对环己烷（C6H12）-THF的分离进行了实验研究，结果表明C6H12-THF的最佳溶剂比为1（溶剂流率为8.12mL/min），此条件下THF回收率为88.9%。也有用其他方法进行回收，如采用萃取精馏法和加盐萃取精馏法[36, 37]等等，但由于各种原因，上述方法均存在一定的局限性，实际运用过程中还没有真正意义上有效回收[31]。
另外，郑仙珏[38]通过分子筛脱水、无水氧化钙、氢化钙或硼氢化钠等方法脱除过氧化物，从而更好的回收THF，可达到工业级THF标准，含水率<0.5%，如果是处理不含过氧化物的THF能贮存更长的一段时间。Chapman等[39-41]使用CM Celfa和CMC-VP-31做渗透膜对THF-H2O混合溶液进行脱水处理也获得了良好的分离效果。
上述方法虽说能够分离纯化回收一定的THF，但由于其工艺流程复杂、设备投资大、操作不易控制、能耗较高等缺点，因此不适宜于长期高效治理THF的污染。
化学方法处理有毒有害难降解的污染物相对于物理方法来说具有较强的应用优势，因其具有高效、快速、操作简单易控制、成本较低等众多优点，从而受到环境学者的重视，国内外学者都有一定的研究报道。
郭红霞[42]通过催脱法处理含有THF的废水，实验结果表明：在最佳处理条件下，对THF废水COD的去除率可达85%～90%。此外，还可以利用卤化氢和THF进行化学反应，生成相应的脂肪族卤化物，从而到达去除THF的目的。
摄丽鹏[43]通过Fenton试剂氧化法、UV/Fenton试剂法以及TiO2光催化氧化法对THF废水进行处理，采用单因素和正交试验优化了THF废水的去除条件。在最佳实验组合下Fenton试剂氧化法、UV/Fenton试剂法和TiO2光催化氧化法对THF废水COD去除率分别约为37%、60%和90%；并通过紫外吸收光谱图和生化验证试验表明，THF虽属于杂环难降解有机物，但通过以上各方法的预处理后，环状结构改变，处理后的废水易被微生物所降解的，以达到去除环境中的THF的效果。
早在1956年，Shuikin和Belsky[44]就研究了THF和2-甲基四氢呋喃与无水卤化氯（三氯化铝和三溴化铝）间的相互作用。他们发现THF和三氯化铝反应生成l,4-二氯丁烷；2-甲基四氢呋喃与三氯化铝或三溴化铝反应分别生成1,4-二氯戊烷或l,4-二溴丁烷。杨阿喜和葛纪龙[45]将在格氏反应生产过程中产生的THF，通过用氯化氢气体开环（以无水氯化锌作催化剂）得到4-氯丁醇-1，最终制备医药原料环丙基甲酸，应用于医药生产当中。
THF是一种饱和环醚，在室温下性质很稳定，有研究证明室温下THF和碱、氧化剂、还原剂一般都不会发生反应，性质很稳定，且经过两年的时间都没有发生降解，这说明了通过普通的物理化学作用很难降解THF[30, 46]。因此，生物降解是去除具有稳定性质的化合物有效方法，随着THF降解菌的筛选，THF的生物降解研究逐渐成为热点。
虽然利用物理化学方法可以去除环境中含有的THF，但均存在技术设备要求高、费用较高、操作复杂不易控制、可能产生二次污染等不足，在实际应用的过程很难实施。而微生物分解法则是利用天然土著微生物或人工培养驯化微生物的新陈代谢作用，以污染物为主要生长碳源和能源来降解有机污染物，具有运行成本低、无二次污染等优点，被称为“绿色”的污染治理技术。有机化合物在微生物作用下转变成结构较简单的化合物或被完全分解的过程称为生物降解。有机物被微生物彻底分解，释放出无机产物二氧化碳与水，称为终极降解，最终将有机污染物分解成无污染的物质。微生物的代谢类型丰富多样，根据对氧气的需求，可分为好氧、厌氧和兼性好氧微生物三大类型。
1.4.1.1 THF的厌氧降解研究
由于THF的厌氧降解研究的条件要求比较高，能够在厌氧环境下降解THF的微生物种类也比较少，目前为止，对于THF的厌氧微生物降解的研究报道较少，在2003年，王怡和彭党聪[47]研究了THF废水的厌氧产气及其去除率，探索了THF的厌氧降解能力。在进行单基质与共基质条件下不同浓度THF的产甲烷率测定时，发现在厌氧单基质条件下，THF对厌氧消化产生轻微的抑制作用，厌氧共基质条件下，THF浓度的增加反而有利于甲烷气体的产生。另外，研究还表明THF 的 COD/BOD 大约为 0.096，小于0.1，属好氧难降解有机物。同样，郭红霞[44]关于THF的厌氧静态实验结果表明THF是一种难降解物（CODBD/COD=6.29%），当THF废水浓度高达约1700mg/L时，厌氧活性污泥的产甲烷活性也会被抑制50%，但去除THF只加入乙酸基质后恢复了一定的活性；当去除第一次投加的THF后再次加入与前次相同量的该物质后，该活性污泥在含有THF的条件下进行诱导，从而到达了一定的驯化作用。
由于THF的环醚结构含有高能键C-O（360 kJ/mol）[46, 48]，并且其COD/BOD（小于0.1）比较低，从而被认为是一种很难被生物降解的化合物，这给生物降解THF的研究提出了很大的挑战。
自从德国学者Bernhardt和Diekmann[49]于1991年首次分离出一株能以THF为唯一碳源生长的红球菌属（Rhodococcus sp.）菌株219，给THF的微生物降解开辟了新的研究方向。研究表明，菌株219在添加适量THF底物的基础培养基和复合培养基上能够迅速生长，具有良好的生长状态，并且对环氧乙烷、l,3-环氧戊烷、THF等脂肪环醚均有良好的降解效果。在最适生长条件下，THF浓度为7.5mmol/L时，菌株219的最高生长速率μ为0.019h-1，THF的降解速率为28.5mg/(h·g)（细胞得率为0.55）。当THF浓度提高到10mmol/L时，菌株219的延滞期和世代时间大大延长、生长速率降低，这可能是此浓度的THF对菌株219的生长具有一定的抑制和毒害作用，从而影响了其对THF的降解。在1996年，Book等[50]根据生理生化特性以及16s rRNA的特性对菌株219进行了鉴定，并命名为Rhodococcus ruber 219。
Parales等[51]从被二氧杂环己烷污染的污泥中分离到l株属于假诺卡氏菌属（Pseudonocardia sp.）放线菌株CB1190 （ATCC 55486），该菌能够较快的降解THF，且世代时间较短，但是具体的THF降解途径和降解的机制还未详细报道和研究，Kohlweyer等[52]从污水处理厂活性污泥中分离到l株在有氧条件下能以THF为唯一碳源和能源生长的放线菌K1，根据细胞的化学成分、形态学特征以及16S rRNA碱基序列初步将菌株K1鉴定为假诺卡氏菌（Pseudonocardia sp.）。该菌的16S rRNA碱基序列与氧化烃假诺卡氏菌（P. hydrocarbonoxydans）的相似性为99.3%，与苯诺卡氏菌（P. benzenivorans）的相似性为98.8%，与氧化硫化物假诺卡氏菌（P. sulfidoxydans）的相似性为98.3%，与其他假诺卡氏菌的相似性低于97%。化学分类学数据也支持K1属于假诺卡氏菌属。尽管菌株Kl和P. benzenivorans，P. sulfidoxydans与P. hydrocarbonoxydans都能利用THF，但DNA-DNA杂交结果和生理生化特性的差异表明Kl不同于它们，因此Kampfer等[53]最终鉴定为其为一个新种，并命名为Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans。该菌在pH 7.0、温度28℃条件下，能在72h内将无机盐培养基中20mM THF完全降解，世代时间为14h；但是当THF浓度高于20mM时，即使额外添加氮源也无法将THF彻底矿化，其最高能耐受60mM的THF。
Day等[54]从某工业污水处理厂的污泥中驯化得到了一批能够以THF为唯一碳源和能源的好氧微生物混合培养物，并将其投加到生物反应器中研究其降解THF的能力。随后将其反应器中的微生物进行分离纯化，最终获得了2株纯的THF降解菌，并研究分析了他们的生理生化特性和16S rRNA序列相似性，最后鉴定并分别命名为Pseudonocardia sp．M1和Rhodococcus ruber M2。随后，Nakamiya等[55]从污染土壤中分离得到一株能以多种环醚类物质为唯一碳源的菌株，该菌株也对THF也有良好的降解效果，经微生物菌种鉴定为Cordyceps sinensis。Vainberg等[56]从处理精细化工废水的膜生物反应器中富集到一种能降解THF的Pseudonocardia sp. ENV478。
李钧敏等[57]从某化工厂的活性污泥中分离出12株THF降解细菌，经鉴定均为 （Aeromonas sp.），并研究了这些菌的一些形态特征和生理生化特性。对其中两种降解效果最好的菌株进行深入研究，结果表明两菌株的最适生长温度为30℃，最适生长的pH值为7.5。并对这两株菌体内的质粒进行了研究，通过质粒消除实验，发现质粒对THF的耐受性以及降解能力都有明显的影响，显示质粒与菌株生长特性的变化有一定的联系，这些菌株中降解THF的基因可能在质粒上。
姚燕来等[58]从多种混合污泥中富集得到一株能耐受高达200mM THF的降解菌Rhodococcus sp.YYL，是目前耐受浓度最高的THF降解菌。通过单因素法，确定影响菌株YYL降解速率的四大主要影响因素pH、K2HPO4·3H2O、NH4Cl和酵母浸出液（yeast extract）。同时，对其培养和降解条件进行了优化，在最佳组合条件下，R. sp.YYL的最大比生长速率和THF降解速率分别增至0.089/h和137.60mg THF/(h·g细胞干重)，相应的细胞得率为0.64mg细胞干重/mg THF。
综上所述，目前报道能够以THF为唯一碳源和能源物质或者能够降解THF的微生物种类还是相对较少，只发现红球菌属Rhodococcus sp.，假诺卡氏菌属Pseudonocardia sp.，气单胞菌属Aeromonas sp.中少数几个菌株以及真菌Cordyceps sinensis能利用THF。但已筛选到的THF降解菌均存在着降解活性低及其以THF为唯一碳源和能源时生长缓慢等问题，目前文献报道的THF降解菌见表1-1。
表1-1 已报道的四氢呋喃降解菌[59]
Table1-1 The reported Tetrahydrofuran degradation microbes[59]
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微生物 |
分离来源 |
报道年份 |
类别 |
分离底物 |
耐受浓度（mM） |
|
Rhodococcus sp.strain 219 |
- |
1991 |
放线菌 |
THF |
10 |
|
Pseudonocardiaceae CB1190 |
Sludge |
1994 |
放线菌 |
1,4-Dioxane |
- |
|
Pseudonocardia sp. strain K1 |
Wastewater plant |
2000 |
放线菌 |
THF |
60 |
|
Rhodococcus aetherivorans strain M8 |
Water sludge |
2001 |
放线菌 |
THF |
35 |
|
Pseudonocardia sp. strain M1 |
Membrane bioreactor |
2003 |
放线菌 |
THF |
11.1 |
|
Rhodococcus ruber strain M2 |
Membrane bioreactor |
2003 |
放线菌 |
THF |
11.1 |
|
Cordyceps sinensis |
Soil |
2004 |
真菌 |
1,4-Dioxane |
- |
|
Pseudonocardia sp.strain ENV478 |
Membrane bioreactor |
2006 |
放线菌 |
THF |
12 |
|
Rhodococcus sp.strain YYL |
Activated sludge |
2008 |
放线菌 |
THF |
200 |
|
Mycobacterium sp.PH-06 |
River sediment |
2008 |
放线菌 |
1,4-Dioxane |
- |
|
Graphium sp |
- |
2009 |
真菌 |
Alkanes |
- |
|
Pseudomonas oleovorans DT4 |
Wastewater plant |
2010 |
变形细菌 |
THF |
100 |
|
Flavobacterium |
Soil |
2011 |
拟杆菌 |
1,4-Dioxane |
- |
|
Pseudonocardia sp.D17 |
Soil |
2013 |
放线菌 |
1,4-Dioxane |
- |
|
Mycobacterium vaccae JOB5 |
Soil |
2013 |
放线菌 |
Alkanes |
- |
|
Afipia sp.D1 |
Soil |
2013 |
变形细菌 |
1,4-Dioxane |
- |
|
Mycobacterium sp.D11 |
Soil |
2013 |
放线菌 |
1,4-Dioxane |
- |
虽然目前国内外关于微生物降解THF的研究报道逐年增多，筛选出有降解THF能力的微生物种类也有所增加，但是研究内容主要是集中在宏观方面的应用，但对其代谢机理的研究尚处于初步探索阶段，至今还没有确定具体的代谢途径和分子机制。
目前，关于微生物降解四氢呋喃的降解途径并没有明确其代谢过程，科研工作者只是从他们的研究过程中，对四氢呋喃的代谢过程做出了一些相关的推测，由于THF是一种单体化合物，结构相对简单，而微生物的降解过程是一个迅速连续的过程，导致大部分中间代谢产物瞬息变化，不易积累，所以很难检测到具体相关的代谢产物。最终，具体详细的代谢过程也难以确定。目前推测的微生物降解THF途径有两个方向：氧化途径（oxidation pathway）、水合作用途径（hydration pathway）（如图1-1所示）。
氧化途径如下：首先，THF氧原子邻位的碳原子被羟基化而生成了2-羟基四氢呋喃，再继续氧化生成γ-丁内酯，γ-丁内酯也有可能是2-羟基四氢呋喃自发进行异构化而非生物酶催化形成的，再由γ-丁内酯开环生成4-羟基丁酸，4-羟基丁酸进一步氧化生成丁二酸（琥珀酸），最后进入三羧酸循环，整个过程中，物质的代谢变化都有能量的不断消耗和生成，最终THF代谢完成所产生的的能量给生物体的生长提供了保障。最早是由Bemhardt和Diekmann在Rhodococcus strain 219中发现了THF降解可能的氧化途径，Rhodococcus strain 219能够利用THF，但是不能利用3-羟基四氢呋喃；能利用γ-丁内酯且速率和THF的利用速率相同[60]，该研究表明了菌株219利用THF是通过氧化途径完成的。Thiemer[52, 61, 62]等利用另一种Pseudonocardia sp. strain K1研究THF的降解途径时，同样未能检测到相关的代谢中间产物。Tajima[63]等利用Rhodococcus aetherivorans strain M8 去降解10mM THF，收集代谢产物，再利用苯基硼酸盐对代谢产物进行衍生化处理，利用GC-MS检测出4-羟基丁酸。此外，对真菌Graphium sp.strain ATCC58400降解THF的途径也有研究，但是最后通过GC-MS也只是检测到了γ-丁内酯，这说明了真菌Graphium sp.strain ATCC58400 降解THF也是通过氧化途径来完成的[64]。
水合作用的途径是THF先通过水化反应生成1,4-丁二醇，然后再继续被生物体内相关的氧化酶催化氧化生成4-羟基丁醛，再生成4-羟基丁酸，最终生成的产物进入三羧酸循环为生物体的细胞生长代谢提供能源和必要的碳源物质。水合作用途径和氧化途径不同的是THF到4-羟基丁酸的过程，通过水合作用途径降解THF的菌体报道的较少[65]。
微生物通过氧化或水合作用的途径将THF转化为琥珀酸，最终进入三羧酸循环，为微生物体的代谢活动提供相应的碳源和能源物质，在微生物体内琥珀酸的含量变化和THF的降解密切联系。
图1-2 四氢呋喃的微生物代谢途径[63]
Fig. 1-2 Microbial metabolic pathway of tetrahydrofuran[63]
THF作为一种“万能溶剂”和重要的有机中间体，在工业生产中已得到了广泛的应用，且使用量正在逐年增加。近年来，国内外很多的医药化工厂都产生了大量的THF，大部分用作生产医药原料，但是在化工医药行业中排出的废水中含有大量的THF，虽然企业会做适当处理，还是会有少部分THF会以废水、废气的形式排放到环境当中。虽然THF属于一种相对低毒的有机溶剂，但是随着THF在化工医药领域的应用范围不断增加、用量不断增大，且TFH易挥发，因此在自然环境中的含量也逐年增加，给生态环境和人类健康带来一定的危害。全球范围内或多或少的有检测到THF的存在，由于THF的高蒸汽压和水溶性的特性，使得人们极易暴露于THF中。毒理学研究表明，THF对中枢神经系统具有一定的抑制作用，对皮肤和粘膜有刺激作用；高浓度下，有麻醉作用、肝脏毒性和致死作用；且THF具有一定的致癌性，能增加肾小管肿瘤和癌症的患病率。此外，THF废水排放会抑制活性污泥好氧呼吸和厌氧消化以及磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶活性，强烈抑制脱氢酶活性，从而破坏生态环境生物活性。因此，如何利用微生物生物技术高效降解自然环境中的THF，减少甚至杜绝其排放，对于全球环境生态的保护和人类自身的健康具有重要的理论意义和实际意义。
由于THF是含氧杂环类物质，采用普通的高级氧化如臭氧法难以将其降解。国内外去除THF主要集中在一些物理化学的方法，如：吹脱法、萃取-精馏法和渗透汽化-汽化渗透膜法等。这些方法虽然都有各自的优点，但设备投资与运行费用较高，技术管理要求严格，可能还会引起二次污染，不适宜于THF环境污染的实际治理。近年来，一些THF降解菌的陆续发现和筛选，给环境科研工作者研究THF的降解机制提供了更多的研究资源和研究材料，尤其是通过好氧微生物降解的方法来降解THF已成为一个研究热点。但已报道的THF降解菌株均存在降解活性低及其以THF为唯一碳源和能源时生长缓慢等问题。由于去除效率与微生物数量及其活性息息相关。因此，对相关微生物降解THF的特性及代谢途径的研究和认识，是提高THF降解菌生长速率及其对THF降解效率的关键所在。国内虽已开始关注THF对环境的污染以及对人体健康带来的危害，并有一些对其毒性、检测方法、物理化学降解研究和生物降解研究进展方面的报道，对THF污染治理技术的研究仍处于起步阶段[58-60, 66, 67]，对THF生物降解的分子机制研究甚少。
国内外已有研究报道THF的微生物降解特性，已经获得了一些具有降解能力的微生物，并对THF的代谢途径有了一定的推测和了解。但是关于THF的微生物降解和转化的研究尚存在一些不足之处：①研究多侧重于生物反应器等工程应用方面，在其微生物降解机理，特别是在基因和酶方面研究较少；②THF降解过程中获得的酶多为粗酶液纯化物，其编码基因大多没有明确；③已知的THF降解过程中不同降解步骤的酶多来自不同菌株，至今没有一个完整的降解酶系统；④THF降解主要集中在宏观方面的研究，微生物降解转化的分子生物学机制研究很少。因此，通过微生物学、分子生物学、生物信息学、遗传学等方法在基因水平上阐释THF的微生物降解机制，对环境中THF的生物处理具有一定的理论指导意义和实际应用的价值。
本论文的研究内容主要是围绕本实验筛选出来的食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）DT4降解THF来展开研究的，首先对野生菌DT4进行质粒检测和消除实验,研究菌株DT4一些相关的特性是否与体内的质粒有关，尤其是THF的降解特性和抗生素的抗性。另一方面通过生物信息学的技术从微观方面来揭示菌株DT4的相关功能基因，测定全基因组序列，通过相关的数据库和软件分析菌株DT4特有的相关功能基因。然后再利用转座子随机插入突变的方法来构建基因文库，挑选突变菌株。采用SEFA-PCR的方法将突变基因进行克隆，通过体外功能鉴定和体内基因敲除的方式研究突变株表型与基因型之间的关系。并且对突变株进行测序、拼接、注释和分析，在NCBI软件进行基因序列比对，功能基因的分析，进一步从分子生物学的角度来阐释THF的降解途径和相关的降解基因。最后从分子生物学、生物化学、生物信息学和遗传学水平阐述Pseudomonas oleovorans DT4降解THF的分子机制。
