1.4.ATRP合成方法

　　运用聚合的方法将特定的功能化的活性基团引入到我们合成的材料中，从而提高材料的功能性和活性是很有意义的。

　　原子转移自由基聚合(ATRP)是可控自由基聚合中一种有力的方法。ATRA或者原子转移自由基加成，它是一种通过过渡金属的催化作用形成碳-碳键的方法。顾名思义，反应过程中的原子转移步骤是聚合物链增长反应中的关键步骤。ATRP(或过渡金属介导的活的自由基聚合)是在1995年分别由Mitsuo Sawamoto30和Krzysztof Matyjaszewski31发现的。

　　原子转移自由基聚合(ATRP)通常使用过渡金属配合物与烷基卤化物作为催化剂和引发剂。各种过渡金属配合物，即那些铜，铁，钌，镍，锇，等，都已被用作原子转移自由基聚合的催化剂。在一个ATRP反应过程中，反应底物被过渡金属复合物通过一个电子转移过程激活，产生自由基;同时，过渡金属被氧化成更高的氧化态。这个可逆过程迅速建立起一个平衡。聚合物链的数量是由引发剂的数量来确定的。每个生长链具有相同的概率与游离的单体反应形成活性/休眠聚合物链(R-PN-X)。其结果是，我们可以制备具有相近分子量的及分子量分布窄的聚合物。ATRP反应非常稳健的，因为它们耐很多的存在于单体或者引发剂上的功能性基团，像烯丙基，氨基，环氧基羟基以及乙烯基等31。原子转移自由基聚合(ATRP)方法有着以下优势，比如易于制备，易于购买以及催化剂(铜复合物)，吡啶配体和引发剂(卤代烷)价格低廉。

　　原子转移自由基聚合反应由四个重要的组分组成。他们是单体，引发剂，催化剂和溶剂。

　　A.单体

　　通常在原子转移自由基聚合(ATRP)中使用的单体是具有能够稳定传播中的自由基的取代基的分子例如，苯乙烯类，(甲基)丙烯酸酯，(甲基)丙烯酰胺，丙烯腈等32。

　　B.引发剂

　　正在生长的聚合物链的数量是由引发剂来确定。有机卤化物常常选为原子转移自由基聚合(ATRP)反应的引发剂，大多数引发剂为烷基卤化物。烷基溴化物具有比烷基氯化物更高的反应性，两者都对聚合物的分子量有着很好的控制33。引发剂的形状或结构可以确定聚合物的体系结构。例如，单核多烷基卤化物引发剂可产生星形聚合物34。

　　C.催化剂

　　催化剂是原子转移自由基聚合(ATRP)反应的最重要的组成部分，因为它决定了活性和非活性成分之间的平衡常数。

　　对金属催化剂有以下几个要求：

　　需要有由一个电子分隔的两个氧化态

　　金属中心与卤素之间的亲和性要合理

　　金属的配位层需要是能够伸展的，当它被氧化，能够容纳卤素

　　过渡金属催化剂不应导致显著的副反应，如增长中的自由基之间的不可逆偶联反应和催化自由基终止等

　　被研究最多的催化剂是那些包含铜的复合物，它们表现出了很好的灵活性和通用性，能够成功的催化聚合多种单体。

　　D.溶剂

　　一般有甲苯，1,4-二氧六环，二甲苯，苯甲醚，DMF，DMSO，水，甲醇，乙腈和其它溶剂被使用。

　　1.5. 透明质酸

　　透明质酸是存在于所有组织中的天然细胞外基质(ECM)的重要组成部分35,36。它是一种独特的带有负电性的高分子聚合物。是一种由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。在体内透明质酸的分子量从5千到2千万道尔，透明质酸能够特异性结合CD44(一种位于细胞膜上的细胞外基质蛋白)，并能够激活和调节多种细胞反应。CD44是在肿瘤中过表达，并在正常组织中低表达的细胞表面标记物。透明质酸与CD44的特异性结合以及大分子在肿瘤内部的的EPR效应为实现肿瘤靶向提供了新的选择。透明质酸已经被广泛开发和应用，其主要有以下几点优势：(1)透明质酸来源于体内，具有很好的生物相容性;(2)透明质酸呈负电性，能够保护纳米颗粒和调节纳米颗粒在体内的循环时间及生物分布;(3)透明质酸可以很方便的通过共价键修饰或静电吸引而对纳米粒子进行修饰;(4)透明质酸能够特异性结合CD44，提高纳米粒子的肿瘤组织靶向性。

　　透明质酸透过受体介导信号传导途径对肿瘤的生长、粘附、转移起着重要的作用。在恶性肿瘤细胞表面的CD44受体对透明质酸具有很高的亲和力,能将其结合后介导胞吞作用将其内吞,从而达到向肿瘤外周组织侵犯及远处转移的目的。

　　1.6. 本论文选题思路

　　如何利用肿瘤微环境，通过合理的材料设计，实现对肿瘤组织的靶向性，缓释性给药，是很有挑战性的工作。众多的科研工作者做了大量的出色的工作，为进一步攻克癌症难题做出了重要的贡献，也为之后进行抗癌研究的人提供了很好的示范和参考。

　　在癌症化疗中，能不能实现药物分子的高效，定向运输以及可控释放对于治疗效果能否实现是非常关键的，这就对药物载体材料提出了很高的要求。因此，我们需要对载体材料进行一系列的合适的结构改进和功能化修饰，以提高载体材料的性能，优化治疗效果。

　　本论文中，我们从介孔硅纳米粒子出发，通过原子转移自由基聚合反应将一段具有pH响应性的聚合物链段接枝到硅球表面，以赋予载药纳米粒子的酸响应性，同时将透明质酸通过静电相互作用组装到硅球的表面，透明质酸的引入，不仅可以增加纳米粒子的生物相容性，减少纳米粒子被巨噬细胞的吞噬，从而延长纳米粒子在体内的循环时间(图13)，而且能够赋予纳米粒子一定的肿瘤靶向性和酶响应性。

　　本论文中设计的同时具有靶向和酸响应功能的聚合物-无机复合药物载体，能够利用肿瘤的特异表达的酶和微酸性环境，实现药物载体的靶向和药物分子的刺激响应性释放(图14)，在癌症治疗研究方面具有很高的研究价值和深远的意义。

　　2.实验部分

　　2.1.实验试剂与药品

　　其中，溴化亚铜需要精制，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)在使用之前需要重蒸。其他的试剂都可以直接使用，不需要进一步纯化。

　　2.2.仪器和测试方法

　　2.2.1.实验过程中所使用的仪器如表2所示。

　　2.2.2.表征方法

　　傅里叶变换红外光谱：

　　用傅里叶变换红外光谱分光光度计来分析,样品采用溴化钾压片。

　　Zeta电位测量：

　　纳米粒子在去离子水(pH 7.0)中的Zeta电位在纳米-ZSZEN 3600粒子仪基础上测量。

　　热重分析：

　　热重分析用TGS-2热重量分析仪测定，测试温度为50-800℃。

　　荧光分光光度法：

　　纳米粒子的载药量及不同pH下的释药行为测定用RF-5301PC仪器进行。

　　2.3.合成方法

　　2.3.1介孔二氧化硅纳米粒子的合成

　　将0.55g的十六烷基三甲基溴化铵溶解于200mL去离子水中，加入3mL浓度为2M的氢氧化钠溶液，加热至80℃。在剧烈搅拌下将2.5g 正硅酸乙酯缓慢滴加至上述溶液中，混合物在80℃下剧烈搅拌2h，得到介孔二氧化硅纳米粒子37。之后，对反应液进行离心(8000r/min，5min)，分别用水和甲醇清洗3-4次后真空干燥，得到约0.8g的白色粉末。产物用TEM和SEM表征。

　　在碱性环境中，正硅酸乙酯的水解反应分以下两步进行(见图16)：

　　第一步：正硅酸乙酯的水解形成羟基化的产物和相应的醇：

　　Si(OC2H5)4+4H2O = Si(OH)4+4C2H5OH

　　第二步：硅酸之间或者硅酸与正硅酸乙酯之间发生缩合反应：

　　2.3.2.介孔硅后修饰

　　2.3.2.1.氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的合成

　　将0.7g介孔硅超声分散至55mL甲醇中，向其中加入1.55mL三甲氧基[3-(氨基)丙基]硅烷，在室温下剧烈搅拌24h得到氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子MSN-NH2，对反应液离心(9000r/min，10min)，用甲醇清洗5次后真空干燥，得到白色粉末约0.51g，产物用FT-IR和电势仪进行表征38。

　　2.3.2.2.氨基化硅球除孔

　　将0.51g氨基化的介孔硅球超声分散至60mL甲醇中，滴加3mL浓盐酸，在60℃下搅拌回流48h，对反应液离心(9000r/min，10min)，用甲醇清洗5次后真空干燥，得到白色粉末约0.50g，产物用FT-IR和电势仪进行表征。

　　2.3.2.3.氨基化的硅球溴化修饰

　　将0.47g氨基化的介孔硅和50mL纯化后的DMF，加入到100mL烧瓶中，超声至分散均匀。将0.60g 2-溴异丁酸，0.46g N, N-二异丙基碳二亚胺和0.52g 羟基苯并三唑加入到10mL的DMF中溶解，然后将该溶液用滴管缓慢的滴加到硅球溶液中，室温搅拌下反应48h。产物用DMF反复洗涤多次，真空干燥过夜，得到白色粉末，用FT-IR和电势仪进行表征。

　　2.3.2.4.硅球表面引发ATRP反应

　　将100mg溴化的硅球，36mg溴化亚铜(0.25mmol)，43.5mg五甲基二乙基三胺(0.25mmol)，1.388g甲基丙烯酸二甲氨基乙酯与6.0mL甲醇加入到容积为20mL的洁净干燥(铬酸中浸泡48h，超声洗涤后于100℃下烘干)的封管中，经过三次冷冻-抽气-解冻的循环后，用酒精喷灯进行封管，将密封好的封管放入70℃的恒温油浴锅中反应48h，产物用甲醇反复洗涤多次，真空干燥过夜，得到白色粉末，用FT-IR和电势仪进行表征。

　　2.3.3.硅球纳米粒子载药

　　2.3.3.1.载药

　　称取10.5mg阿霉素溶于2mL去离子水中，配制成阿霉素溶液。同时将27.4mg聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯修饰的硅球纳米粒子，超声分散于2mL去离子水中，在搅拌下将阿霉素溶液滴加至硅球纳米粒子中。由于所合成的材料是酸响应的，因此，在酸性条件下，聚合物伸展，利于药物的载入;相反，在碱性条件下，聚合物收缩，能够达到封堵药物的效果。滴加浓度为1M的稀盐酸，调节混合液体的pH至5-6，使硅球表面聚合物链处于伸展状态。之后，剧烈搅拌48h，充分载药。载药过程以及之后的处理和表征过程都要注意避光。滴加浓度为1M的氢氧化纳溶液将溶液pH调回至中性。对反应液进行离心(8000r/min，5min)，用水清洗3-4次后真空干燥。

　　2.3.4.载药量测定

　　pH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)的配制：

　　称取磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.44g，氯化钠7.9g以及氯化钾0.2g于容积为lL的大烧杯中，加入600mL去离子水，充分搅拌至溶解。将溶液转移到1L的容量瓶中，少量水多次洗涤烧杯转移至容量瓶中，滴加浓盐酸/浓氢氧化钠至pH=7.4，定容至溶液总体积为1L。

　　pH为6.5的磷酸缓冲液(PBS)的配制：

　　称取磷酸二氢钾0.94g，磷酸氢二钠0.46钠7.9g以及氯化钾0.2g于容积为lL的大烧杯中，加入600mL去离子水，充分搅拌至溶解。将溶液转移到1L的容量瓶中，少量水多次洗涤烧杯转移至容量瓶中，滴加浓盐酸/氧化钠至pH=6.5，定容至溶液总体积为1L。

　　称取载药纳米粒子，加入200uL氢氟酸溶解，加入4mL pH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)稀释，少量浓度为2摩尔每升的氢氧化钠调节溶液的pH至7.4。荧光测定Dox载药量。具体的测定参数设置为：

　　Ex wavelength: 488 nm

　　Em wavelength: 500nm to 590nm

　　Scan speed: very fast

　　Slit width: 5.0 nm EM: 5.0 nm