2.3.5.氨不同pH条件下释药曲线测定

　　称取16.7mg的透明质酸于10mL塑料管中，加入6mL配制好的pH为7.4的磷酸缓冲液(PBS);称取磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g以及氯化钾0.2g于容积为lL的大烧杯中，加入600mL去离子水，充分搅拌至溶解。将溶液转移到1L的容量瓶中，少量水多次洗涤烧杯转移至容量瓶中，滴加浓盐酸调节溶液的pH至7.4，最后定容至1L。

　　称取10.5mg最终的样品于1.5mLpH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，分散均匀，加入少量的透明质酸酶，转入15cm长的透析袋(Mw cutoff:8000~12000 Da)中。将装有样品的透析袋浸泡到pH为7.4的磷酸缓冲液(0.1 M，50 mL)中，置于摇床中37℃释药。按照设定的时间间隔()从透析袋中取出10mL溶液，并补加10mL相应的pH为7.4的磷酸缓冲液于透析袋中以保证透析袋中的溶液总体积保持不变。取出的溶液通过荧光分光光度计测定其在波长为560nm处的荧光强度，利用标准曲线计算溶液中的Dox浓度，从而得到Dox释放量。累积释药曲线计算公式37为：累积释药量(%)=(Mt / M∞)× 100，其中Mt是指t时间内，药物的释放量，M∞是指载药纳米粒子包裹的药物总量。具体的测试参数如下：

　　EX wavelength: 488 nm

　　Scan speed: very fast

　　Slit width: 5.0 nm EM: 5.0 nm

　　pH为6.5的磷酸缓冲液中的释药曲线测定步骤同上，测试条件同上。称取的样品量为6.8mg。

　　3.结果与讨论

　　3.1介孔硅纳米粒子的尺寸分析

　　在本论文中，我们成功制备了平均粒径为184nm的介孔纳米粒子，其粒径测试结果如图18:

　　我们进一步运用多种手段，对合成的介孔纳米粒子的外部形貌和内部结构做了表征，如图。从纳米粒子样品SEM(图A)和TEM(图C)图像中观察到纳米粒子存在2-3nm大小的有序晶格阵列的孔道。从样品的EDX能谱图(图B)可以看出，样品中主要存在硅，氧和碳等元素。其中硅，氧和碳的质量分数分别达到21.46%，36.57%及34.57%。可以证实纳米粒子的主要成分为SiO2，我们的介孔硅纳米粒子是成功合成了的。其中较高的碳的含量，可能是残留的十六烷基四甲基溴化胺和正硅酸乙酯的水解产物。图D为介孔硅纳米粒子包裹透明质酸之后的TEM图像，从图我们可以清晰地看到透明质酸成功的包裹在了介孔硅纳米粒子表面。

　　3.2.纳米粒子的傅里叶红外光谱分析

　　为验证透明质酸包裹的载药纳米粒子(MSN-HA),连接有酸响应的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物的介孔硅纳米粒子(MSN-P)，溴化的纳米粒子(MSN-Br)，氨基化的纳米粒子(MSN-NH2)和介孔硅纳米粒子(MSN)的成功合成，我们测了它们的红外光谱，得到图20，为了便于对比分析红外图谱数据，我们也对透明质酸进行了红外测试，见图21：

　　分析测定的红外光谱图：四个谱图中均在1079cm-1有强吸收峰，判断为Si-O-Si键的伸缩振动产生;795cm-1和958cm-1出现Si-O-Si键的对称伸缩及弯曲振动，这三个峰构成SiO2的特征红外吸收峰，证实纳米球的组分为SiO2，3451cm-1处宽化吸收峰可以判定为硅醇基(-SiOH)的伸缩振动。MSN-P的红外图谱中多出了1731cm-1的峰，判断为酯键的吸收峰，证明了聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯的成功引入。

　　由MSN-HA和HA的红外图谱对比可以看出，我们成功的将HA包裹到了硅球纳米粒子的表面。

　　3.3.纳米粒子的Zeta电势测试分析

　　为进一步验证自保护肽是否成功接入，我们对得到的纳米粒子进行了Zeta电势的测定，得到的数据如表3所示：

　　通过对纳米粒子表面电势的测定，我们也可以大致上判断纳米粒子的成功修饰与否。如图，电势整体趋势有很大的变化，这样一个变化表征了硅球表面基团的变化。由裸硅球到溴修饰的硅球，表面电势由-20.3mV上升到+35.5mV，结合纳米粒子的修饰过程我们可以知道这个变化是由硅球表面的-OH(偏负电性)基团变为含有N元素(偏正电性)的溴化片段引起的。而由聚合物修饰的硅球到透明质酸包裹的硅球，电势由+32.2mV降为-35.7mV，证实了有着较负电势的透明质酸被成功包裹到纳米粒子表面。相关的证据证明这样一个负电性，对延长纳米粒子在体内的循环时间是很重要的。

　　3.4.纳米粒子的热重分析

　　为了进一步证实实验的成功进行，我们对透明质酸包裹的载药纳米粒子(MSN-HA),连接有酸响应的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物的介孔硅纳米粒子(MSN-P)和溴化的纳米粒子(MSN-Br)进行了热重测试。测试结果如图23示。

　　热重分析曲线氨基ga41MSO显示出透明质酸包裹的载药纳米粒子(MSN-HA),连接有酸响应的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物的介孔硅纳米粒子(MSN-P)和溴化的纳米粒子(MSN-Br)在800℃下的质量损失分别为38.02%，43.33%和71.65%。从热重溴化修饰的介孔硅纳米粒子热重数据分析，在120℃之前样品有一个较快的失重过程，我们推测，其质量损失主要是由样品中自由水和结合水的挥发所致，总的失重量约为5%，200℃-800℃之间样品出现缓慢失重，这应该是由硅醇基之间缩合脱水造成的。800℃以后曲线基本上趋于稳定，说明二氧化硅颗粒耐高温性能良好，具有较好的稳定性39。从聚合物修饰的硅球纳米粒子以及透明质酸包裹的硅球纳米粒子热重数据分析，随着温度的升高，二者都有较大的质量损失，分别达到56.67%和61.98%。因为相较于无机成分来说，有机成分耐热性差，硅球纳米粒子的后修饰引入大量的有机成分，因此，失重快，失重率较大。这也在一定程度上可以证明材料的后修饰是成功的。

　　3.5.介孔硅纳米粒子载药量测定：

　　Dox荧光标准曲线为：I=4.83455*10^7(mol/L)-0.07897，将所测数据带入到公式中，所得大致的纳米粒子载药量为4.1%。

　　3.6.不同pH条件下，介孔硅纳米粒子的释药行为：

　　根据荧光测定结果，计算每次测定的释药量，并转换成释药百分比，具体结果做成释药曲线，如图24：

　　分析不同pH下纳米粒子的释药曲线，我们可以知道：在pH为6.5的磷酸缓冲液(PBS)中，载药的纳米粒子释放阿霉素缓慢，24小时后释放曲线基本上趋于平缓，累积的释放量能够达到70%，具有很好的缓释效果;而在pH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，药物在24小时之内总的释药量仅有0.4%，这说明接枝的聚合物具有很好的硅球堵孔效果，能够有效地阻止药物在体内循环过程中的泄露，从而避免对正常体细胞的毒副作用。两者对比，可以有效的证明我们所合成的载药纳米粒子具有很好的pH响应性，能够实现药物只在特定的酸性环境下释放，这对实现良好的癌症治疗效果，尽可能的减少抗癌药物对正常细胞的毒副作用是很关键的。

　　4. 总 结

　　在癌症治疗中，传统的药物载体容易被体内的巨噬细胞吞噬，从而清除，无法使药物到达病灶部位，这大大影响了治疗效果。因此，通过对载体的进行一系列的结构改进和功能化修饰，以实现药物载体的高载药量，刺激响应性，生物相容性和特定靶向性，对癌症治疗有至关重要的意义，也一直是当今科学研究的重点和难点问题。为了较好地实现药物载体的作用，本论文从介孔硅出发，通过原子转移自由基聚合反应将一段具有pH响应性的聚合物连段接枝到硅球表面，以实现载药纳米粒子的酸响应性，同时将透明质酸通过静电相互作用组装到硅球的表面，一方面增强载药纳米粒子的生物相容性，另一方面，在一定程度上靶向肿瘤组织。本实验通过扫描电子显微镜(SEM)，透射电子显微镜(TEM)，EDX能谱，傅里叶红外光谱(FT-IR)，粒径及电势仪，热重分析(TG)，荧光分光光度计和体外释药情况研究等分析手段，对纳米粒子的形貌，结构，组成，稳定性，载药和释药情况进行了详细的研究，对获得大量实验数据和结果进行分析，得到以下结论：

　　(1)我们运用多种分析手段，表征了我们所合成的载药纳米粒子。其中红外图谱中出现的1079cm-1，795cm-1和958cm-1三个峰为SiO2特征峰，1700cm-1峰证明了酯键的成功引入，对应于聚甲基丙烯酸甲酯中的酯键;一系列的电势变化也与反应过程中官能团的变化相一致;EDX能谱分析也显示了SiO2主要成分。结合TEM，SEM等数据，可以证实我们成功合成了设计的目标产物。

　　(2)通过静电相互作用，我们将透明质酸引入到硅球表面，电势结果显示，透明质酸的引入成功的逆转了硅球表面电势，这样一个负电性，有利于避免被吞噬细胞吞噬，从而增大了载药纳米粒子到达癌症肿瘤部位的几率。

　　(3)热重分析曲线氨基ga41MSO显示出透明质酸包裹的载药纳米粒子(MSN-HA),连接有酸响应的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物的介孔硅纳米粒子(MSN-P)和溴化的纳米粒子(MSN-Br)在800℃下的质量损失分别为38.02%，43.33%和71.65%。从热重溴化修饰的介孔硅纳米粒子热重数据分析，在120℃之前样品有一个较快的失重过程，我们推测，其质量损失主要是由样品中自由水和结合水的挥发所致，总的失重量约为5%，200℃-800℃之间样品出现缓慢失重，这应该是由硅醇基之间缩合脱水造成的。800℃以后曲线基本上趋于稳定，说明二氧化硅颗粒耐高温性能良好，具有较好的热稳定性。

　　(4)通过荧光光度分析手段，我们测定了载药纳米粒子的载药量以及不同pH条件下的释药行为。本论文合成的纳米粒子能够实现大约4%的载药量。在pH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，药物在24小时之内总的释药量仅有0.4%，这说明接枝的聚合物具有很好的硅球堵孔效果，能够有效地阻止药物在体内循环过程中的泄露，从而避免对正常体细胞的毒副作用;在pH为6.5的磷酸缓冲液(PBS)中，载药的纳米粒子在24小时内累积的释放量能够达到70%，具有很好的释药效果;两者对比，可以有效的证明我们所合成的载药纳米粒子具有很好的pH响应性，能够实现药物只在特定的酸性环境下释放，这对实现良好的癌症治疗效果，尽可能的减少抗癌药物对正常细胞的毒副作用是很关键的。

　　总而言之，本论文设计了一种基于硅球的新型的刺激响应载体，这种载体接枝了聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯作为酸响应片段：在碱性条件下，聚合物片段呈现疏水性，倾向于收缩状态，实现为硅球堵孔的目的;在酸性条件下，聚合物片段质子化，氢键作用明显，因此，聚合物片段在水中呈现伸展状态，药物被释放出来。通过静电相互作用创新性的引入透明质酸，既能够增强纳米粒子的生物相容性，又能够实现一定程度的靶向性和酶响应性，对实现更

　　好的癌症治疗效果做出了努力，具有广泛而深远的意义和重大的研究价值。