1.绪论
1.1背景
高分子材料载药微球是一种刚发展起来的新型功能微球[1]，由无机磁性粒子与有机高分子材料经适当的途径，有机结合而成的新型复合材料。磁性高分子载药微球作为一种新型功能的靶向药物制剂材料，自1970年以来，科研学者对其的制备机理及应用进行了大量的研究与实验。磁性壳聚糖微球作为一种可降解的高分子载药材料，具有很大的发展潜力和应用前景，已广泛应用于诸多领域中，特别在生物技术和生物医学这两个领域。
肿瘤是一种令人胆颤、严重危害人类的健康及生命的疾病，从上个世纪六十年代开始，化学疗法即抗癌化学药物治疗依然是目前治疗癌症的主要方法与途径，但在治疗的过程中发现大部分的抗癌药物在杀死癌瘤细胞的同时，也会对正常组织或健康的细胞造成杀伤等毒副作用，这在很大程度上影响了其在临床上的广泛应用。若能探索出一种方法或研制出一种新型药物载体，将抗癌药物选择性的输送到癌变细胞上并使其与之结合，干扰和阻止癌细胞的繁殖和扩散，从而将癌细胞杀灭。药物缓控释系统是近些年来比较受关注的一种新型的给药体系，是通过控制药物的释放速率，从而达到缓慢释放抗癌药物的目的，它不仅克服了传统给药途径中药物浓度大幅度波动的缺点，还可保持体内的药物在一定的时间里仍处于有效浓度，从而有利于药物达到最好的治疗效果，有效地降低了药物的毒副作用，提高了药物的稳定性。因此，缓控释载体和靶向给药可降低抗肿瘤药物的毒副作用、提高其药效，引起了抗肿瘤药物科研学者极大的关注[2]。
5-氟尿嘧啶磁性壳聚糖微球是一种新型的高分子功能材料，其制备工艺简单便捷，且反应速度快、效果好，常规实验设备及常温条件下即可进行，避免了由于严控温度给实验操作带来的困难。此外，制备原料易得、价格低廉，其吸收和代谢机理明确且安全可靠。经研究发现，其在外加磁场下可引导负载药物在体内定向移动和持续释放，精确地作用在病变部位，让药物高效地在靶向部位富集，从而提高抗癌瘤药物的靶向性和利用率，有效地延长其药效，减少了人体器官对药物代谢的负担和药物毒副作用，达到缓释、控制的效果[3，4]。药物经其包囊后，良好的可降解性和生物相容性有效降低了对人体的排斥作用。
1.2研究的内容、目的和意义
5-氟尿嘧啶(简称5-Fu)能阻碍脱氧核糖DNA和核糖体RNA的合成而发挥抗肿瘤作用，常被作为临床常用抗癌药物之一[5]。但在治疗的过程中发现大部分的抗癌药物在杀死癌瘤细胞的同时，也会对正常组织或健康的细胞造成杀伤，临床表现为呕吐、腹泻等，甚至出现免疫力下降现象，这在很大程度上影响了其在临床上的广泛应用。影响了临床上的应用。为了延长药效，提高药物的稳定性，缓控释载体和靶向给药可降低抗肿瘤药物的毒副作用、提高其药效，引起了抗肿瘤药物科研学者极大的关注。
壳聚糖是一种资源丰富且无毒的天然碱性多糖分子,独特的理化学功能[6]、良好的生物相容性和可降解性，可形成分子内和分子间氢键[7],具有抗菌消炎、促进伤口愈合、降脂和降低胆固醇等作用[8],让它作为药物控释载体而在生物医学废水处理等领域被广泛的应用[9]。在众多的载体材料中，磁性壳聚糖微球作为一种可降解的高分子药物载体材料，应用于外科手术可吸收缝合线、组织修复材料等生物医学方面[10，11]，其在外加磁场下可引导负载药物在体内定向移动和持续释放[12]，精确地作用在病变部位，让药物高效地在靶向部位富集，从而提高抗癌瘤药物的靶向性和利用率，有效地延长药物作用的时间、减少了人体器官对药物代谢的负担和药物毒副作用。以壳聚糖作载体，采用乳化交联法，将油酸钠、改性Fe3O4、壳聚糖、5-氟尿嘧啶和戊二醛等经过交联反应，制得具有缓释效能的5-氟尿嘧啶磁性壳聚糖纳米微球。并研究交联剂的用量、搅拌速率等最优实验条件对其载药量和药物释放性能的影响。
生物相容性通常是指任一种外来的物质，如治疗时使用的外源性细胞或者人造材料的植入体或纳米粒子等，为达到治疗的目的而植入;或通过某种特殊的方式进入生物体;或与生物体的组织共存时使生物体及其组织发生损害。目前，研究磁性壳聚糖微球的生物相容性[13]，研究与评价生物材料的相容性应在整体、细胞和分子这3个水平全方位进行，进一步完善磁性纳米材料的生物学评价标准，现已被广泛应用于医用材料的生物学评价[14，15]
综上所述，提出了本课题的主要研究内容：
(1)查阅文献资料，比较多种磁性壳聚糖微球的制备方法，制备易降解、强磁响应性和较好的生物相容性的5-氟尿嘧啶磁性壳聚糖微球。
(2)对磁性壳聚糖载药微球进行表征。
(3)完成微球载药量和药物释放性能的测定实验。
(4)空载5-氟尿嘧啶磁性壳聚糖微球生物相容性的评价实验，其中包括细胞的体外相容性实验、血液相容性实验(溶血实验)[16]。
1.2磁性壳聚糖微球
1.2.1磁性壳聚糖微球简述
磁性壳聚糖微球是由乳化交联法，将无机磁性纳米粒子与壳聚糖有机结合起来的具有特定功能和特殊结构的复合型材料。上个世纪80年代初，人们就开始对磁性壳聚糖微球进行了研究。磁性壳聚糖复合微球由改性的Fe3O4与壳聚糖高分子有机结合而成，不仅具有良好的超顺磁特性，在磁场引导下能够迅速的移动，可与介质溶液分开，当把磁场撤走后，又能均匀在溶液中分散开来，从而达到分离、富集、回收和再利用目标物质的目的;磁性壳聚糖微球也具备了高分子材料多样的功能化特性，微球带有-NH2和-0H等活性基团，由活化修饰和共聚反应后可被赋予不同功能性的基团，例如-COOH、-CHO和-SH等。正因磁性壳聚糖微球具有以上优良的特性，所以在环境工程、生物工程和医药工程等领域得到了诸多应用，如污水的处理、酶的固定化、蛋白的纯化和靶向给药等方面，正受到人们的广泛关注，显现出了广阔的应用前景。
1.2.2磁性壳聚糖微球的优点
在众多的高分子药物载体中，磁性壳聚糖微球具有自己独特的优点：(1)磁效应。因包含磁性材料(改性Fe3O4)而具有磁性，当有外加磁场作用时，磁性壳聚糖复合微球能快速地从介质溶液中分离开来;当包裹的改性Fe3O4的粒径不大于30 nm时，则呈现超顺磁性。(2)基团功能化。由于磁性壳聚糖微球的生物高分子材料本身就具有许多的活性基团，如-COOH、-CHO和-SH等，所以能直接与酶和抗体蛋白等生物大分子连接起来，也可采用化学方法来修饰微球表面的活性基团，进而得到特殊结构的功能性微球。(3)生物相容性。制备的磁性高分子微球材料基本都是多糖类、蛋白类物质。在本论文的磁性壳聚糖，具有很好的生物相容性，在人体内可降解且无不良排斥反应，因而在生物医学上可以得到很好的应用，尤其是药物靴定向方面。
1.2.3 磁性壳聚糖微球的制备方法
目前，制备磁性壳聚糖纳米微球的方法包括包埋法、单体聚合法、原位法和乳化交联法等[12]。每个方法都各有各的优点与不足，所以在实际的制备当中应该由生产应用需要来决定合适的制备方法。
(1)包埋法
包埋法是指采用机械搅拌和超声分散等物理方法，让磁性颗粒均匀地悬浮在溶液中，再通过雾化、絮凝等手段制得磁性高分子微球。其操作过程简便易控制、成本较低且微球产量多，因而被广泛采用。但是微球粒径大、形状也不规则、表面乳化剂还难除掉且壳层中易混有杂质，从而在一定程度上限制了其应用。
采用FeNH4(SO4)2和壳聚糖作原料，不加表面活性剂的情况下使用包埋法，制备得多氨基化的磁性壳聚糖纳米微球。经检测，这种颗粒的粒径平均值是208nm，表面呈规则球形形状，氨基的含量高至2.301mmol/g，表现出了较好的超顺磁性和耐酸性，在磁场存在的情况下能迅速分离开来。由化学共沉淀的手段制备了Fe3O4磁性颗粒，通过包埋法将羧甲基壳聚糖直接把Fe3O4磁性颗粒进行包裹，完成了羧甲基壳聚糖磁性微球的制备。
(2)单体聚合法
单体聚合法又称为枝包覆修饰法，是将引发剂、乳化剂或稳定剂等添加到磁性纳米材料和有机单体的混合溶液中，发生聚合反应而制得磁性高分子微球的，是经离子键或络合配位键使高分子材料与磁性颗粒相互结合。由该法合成的磁性复合微球的粒径分布均勾，磁响应性好，但粒径较大，疏水性材料需附带有一定的亲水性时才能得以与亲水性的磁核相结合。单体聚合法根据聚合方式和特点的不同，主要分成悬浮聚合法、分散聚合法和乳液聚合法。
①悬浮聚合法
悬浮聚合是指在机械搅拌或振荡作用条件下，将单体、引发剂、无机物和水等分散成均勾，悬浮于水中发生聚合反应而成聚合物的过程。
②分散聚合法
分散聚合是指将溶于反应介质中的单体，通过聚合反应而生成不溶于该介质里面的聚合物，并且在介质里形成较稳定胶态状的分散系。这种方法在合成较大粒径和单分散磁性聚合物微粒或在微球的表面包裹功能性基团方面占有较大的优势。
③乳液聚合法
乳液聚合是指把乳化剂和引发剂添加到磁性纳米颗粒和水溶性单体的混合液中，再由聚合反应而生成磁性高分子微球。
(3)原位法
原位法是指将一定浓度的Fe2+和Fe3+与高分子材料混合,通过改变体系条件而形成磁性高分子微球的方法。原位法制备磁性高分子微球结构稳定、分散性良好、粒径均一、形状规则、磁含量高,有效地解决了单体聚合法存在的问题，可广泛应用于生物化工、环境污水处理等领域。但因其制备条件较复杂，影响因素较多，对高分子材料的要求也比较严格，只适用于带有能与铁粒子作用基团的高分子材料。
(4)乳化交联法
乳化交联法是指于适合浓度下的壳聚糖乙酸溶液中加入改性的Fe3O4颗粒，均质分散;然后在一定适当的温度、PH值和搅拌速度等条件下逐滴地加入乳化剂而使其形成乳液。之后常压下让其自由挥发或使用真空抽提得手段让溶剂挥发，再进行洗涤、抽滤和干燥等操作后就能得到磁性壳聚糖纳米微球。该法也是目前制备磁性壳聚糖纳米微球最常用的方法。
1.3磁性壳聚糖微球的应用与进展
作为一种发展迅速的新型功能的高分子材料，磁性壳聚糖纳米微球在生物医学、纺织印染工业、废水处理等方面已经有了初步的应用，并且显示出了很好的前景。
1.3.1在生物医药领域中的应用
(1)固定化酶
磁性壳聚糖微球作为一种新型的功能高分子材料，在酶的固定化领域中已经被当作载体进行广泛的应用[13]。因微球表面包裹有很多-NH2、-0H、-COOH和-CHO等多种官能团，经物理吸附、交联和共价耦合等方式，酶分子由此可固定在磁性微球的表面而形成所要固定化酶。磁性壳聚糖微球固定化酶制备过程的操作简便且成本低、无毒、和底物易分离，有效地弥补了游离酶难纯化、易失活、酶稳定性差和重复利用率低等不足。酶通过磁性壳聚糖微球固定后，既完整地保持了其活性，因外加磁场的存在，可让酶定向的移动，这样又可避免了酶结构被传统的固定化搅拌破坏，进而提高了固定化酶的重复利用率和催化效率。
(2)靶向药物的应用
靶向药物也被称为“生物导弹”，它能够提高药物效用，并且还可以将对药物的毒副作用。这项技术是把磁性壳聚糖微球和药物一起包裹在高分子材料里面，形成稳定制剂，然后经动脉注射之后，在外加磁场的引导下，准确地把药物输送至发生病变的部位并且将药物释放出来。 在上个世纪80年代末，磁性靶向药物治疗的难题在Lubbe等人努力下被攻破，并且完成了全世界第一例临床试验，结果呈现出了良好的治疗效果，也表现出很好的耐受性。
使用改变pH值法完成对磁性壳聚糖纳米微球的制备，然后分别完成对其载药量、药物缓释特性以及磁靶向特性的测试。实验结果表明该微球的缓释效果比较明显，而且还出现一定时间段的突释现象，这样使药物浓度在开始阶段时可迅速达到有效的血药浓度，而在随后的缓释中也达到了较长时间的治疗效果，从而提升了药物的疗效和利用率。
(3)免疫诊断分析
因壳聚糖微球兼具有高的顺磁响应性和高比表面积等优点，并且能把功能基因连接起来，所以其在临床使用时可更高效、直观、方便地诊断疾病。当前进行免疫分析时也主要是通过与磁性壳聚糖微球结合的抗原或抗体来完成。Dungchai等人采用了磁酶免疫检测法来完成对人体体液中CEA含量的检测工作，使用碱性磷酸酶ALP来标记癌胚抗原CEA抗体，经分析发现CEA的线性浓度范围为2～162mg/mL，对其灵敏度也达到0.69 mg/mL，这表明了该法高效、准确的特点。
1.3.2在纺织印染领域中的应用
壳聚糖独特的分子构造使得它对许多染料具有很强的亲和性，这些染料包括直接染料、酸性染料和硫化染料等等。壳聚糖在吸附染料时会放热，升温会增加吸附速率，但吸附容量会减小，然而这些对其的应用不会产生太大的影响。研究表明壳聚糖与染料的结合能力会受到染料浓度的影响。废水的pH在染料吸附到壳聚糖表面的过程中也是个重要的影响因素。pH在2.0～7.0时壳聚糖对染料的结合能力很强，而当pH>7.0时结合能力则降低。在酸性条件下，被质子化后的氨基让壳聚糖带上正电荷，然后通过静电的相互作用来吸收阴离子型染料。
1.3.3在废水处理领域中的应用
印染废水的处理：通过磁性壳聚糖微球来完成对染料废水脱色的研究工作，发现了于最优的吸附条件下磁性壳聚糖微球的吸附饱和量会比较大，这说明磁性壳聚糖微球对酸性偶氮的染料废水进行脱色时其效果更好。同时在处理酸性的染料废水时磁性壳聚糖微球表现出了其脱色效率好、试剂用量少、与吸附剂易于分离且能再生等多种特点，在国内外也有很好的应用前景。
1.4体外细胞相容性实验
1.4.1四噻唑蓝法(MTT法)
四噻唑蓝法可检测细胞的存活和生长,其检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶把外源性MTT还原为与水不溶的蓝紫色结晶体—甲瓒(Formazan)，并能沉积在细胞中，而死细胞并没有这个功能。二甲基亚砜(DMSO)能把细胞中的甲瓒溶解掉，用酶联免疫检测仪测它于490nm波长处的光吸收值，这样可间接地反映出活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的数量和细胞数成正比关系。这种方法在一些生物的活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物的筛选、细胞的毒性试验及肿瘤放射敏感性的测定等方面已经被广泛地应用。其特点是灵敏度高且实验成本低，但由于MTT经还原后所产生的甲瓒产物不溶于水，所以需被溶解后才能检测，这不仅增大了工作量，同时还会对实验结果的准确性产生一定影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者产生一定的损害。
1.4.2磁性壳聚糖微球血液相容性实验
血液相性实验是观察受试物是否能引起溶血和红细胞凝聚等反应，其原理是根据红细胞破裂后释放出来的血红素在可见光波长段所具有最大吸收,采用分光光度法测定受试物的溶血程度。因为在一些中药注射剂中含有溶血成分或者物化等方面的缘故，对其直接进行注入血管后可产生一定的溶血作用;也可能由于一些注射剂里含一定的杂质成分，在注入血管后也会发生血细胞凝聚，从而引起血液循环功能障碍等一些不良反应;此外由于药物制剂的成分相较于比较复杂，也会存在有因为免疫反应而引起的免疫性溶血。所以，一般注射剂和会引起免疫性溶血的或者一些非免疫性溶血反应的别的药物制剂都能进行的个溶血性实验
2.实验部分
2.1 5-Fu磁性壳聚糖微球的制备
2.1.1原料和仪器
实验过程中所用到的实验原料和仪器如表2-1和表2-2所示。
表2-1 实验原料
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试剂名称 |
规格 |
生产厂家 |
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5-氟尿嘧啶 |
医疗及 |
西安瑞林生物科技有限公司 |
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四氧化三铁 |
分析纯 |
天津市天力化学试剂有限公司 |
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磷酸盐缓冲溶液 |
pH=6.86 |
上海虹北试剂有限公司 |
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冰醋酸 |
分析纯 |
天津市科密欧化学试剂有限公司 |
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氢氧化钠 |
分析纯 |
天津市天丽化学试剂有限公司 |
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油酸钠 |
分析纯 |
哈尔滨市永强合成化工厂 |
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无水乙醇 |
分析纯 |
沈阳市华东试剂 |
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石油醚 |
分析纯 |
天津市凯信化学工业有限公司 |
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壳聚糖（Mw= 20w） |
分析纯 |
天津市凯信化学工业有限公司 |
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司盘80 |
分析纯 |
成都艾科化学试剂有限公司 |
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25%戊二醛 |
分析纯 |
杭州鲁尔能源科技有限公司 |
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液体石蜡 |
分析纯 |
天津市凯信化学工业有限公司 |
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透析袋 |
截留分子量：3500 pH稳定范围：5~9 |
北京环球兴达科技有限公司 |
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表2-2 实验仪器
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名称 |
型号 |
生产厂家 |
|
集热式恒温加热磁力搅拌器 |
DF101D |
巩义市予华仪器有限公司 |
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数显电动搅拌器 |
DW3 |
巩义市予华仪器有限公司 |
|
永磁直流电动机 |
ZD90W |
北京京伟电器有限公司 |
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紫外可见分光光度计 |
UV2100 |
美国 UNICO |
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电子天平 |
FA2004B |
上海佑科仪器仪表有限公司 |
|
数显恒温水浴振荡器 |
SHZ-82 |
江苏常州菲普实验仪器厂 |
|
离心机 |
802 |
金坛市城西春兰实验仪器厂 |
|
真空干燥箱 |
PHO50A |
上海一恒科技有限公司 |
|
循环水式多用真空泵 |
SHZD111 |
巩义市英峪仪器厂 |
|
超声波清洗器 |
KQ2200 |
昆明市超声仪器有限公司 |
|
扫描电子显微镜 |
SU3500 |
日本日立公司 |
