2.1.2改性Fe3O4纳米粒子的制备
将0.1g(4.3×10-4 mol)的Fe3O4颗粒分散在盛有100mL去离子的水烧杯中，使用超声波清洗器超声3min，采用10%的乙酸溶液将Fe3O4悬浮液的pH值调节至5.5～6.0，然后把Fe3O4悬浮液转移到一个已经安装好了的250mL的三口烧瓶(配有直型冷凝管和搅拌器)中，再将其放置于以500rpm的搅拌速率搅拌的80℃的恒温水浴中，5min后加入加入1mL15wt%的油酸钠，此时开始记为反应时间并持续搅拌，反应1h后再使用10%的NaOH溶液调节溶液的pH值至7。待悬浮溶液冷却，使用离心机将其离心分离，之后依次采用无水乙醇和去离子水将所得到的微粒洗涤，进行真空抽滤，最后将产物置于60℃的真空干燥箱中干燥24h。可多制备些改性Fe3O4以备用。
2.1.3 5-Fu磁性壳聚糖微球的制备
按3mg/mL的配比来配制壳聚糖乙酸溶液，然后将0.1g改性Fe3O4和壳聚糖质量10%的5-氟尿嘧啶加到20mL之前配置好的壳聚糖乙酸溶液中，边搅拌边缓慢加入1mL司盘80和120mL液体石蜡的混合溶液，超声3min后将其转移到已经安装好的三口烧瓶中，搅拌5min后加入4mL25%的戊二醛溶液，此时为反应开始，以800rpm的搅拌速度让其反应， 30min之后停止反应，待悬浮液冷却至室温后，将其pH值调节至9，然后把得到的悬浮液静置于40℃的恒温水浴中陈化40min，之后依次使用石油醚、乙醇和去离子水将悬浮液洗净，再进行真空抽滤，最后将产物放置于60℃的真空干燥箱中干燥24h。这样就可得到5-氟尿嘧啶磁性壳聚糖微球。同理不加入5-Fu而进行同上操作即可获得空载磁性壳聚糖微球。
2.1.4 对磁性壳聚糖微球电镜扫描
采用最佳的制备条件来制备得到磁性壳聚糖微球后，使用扫描电子显微镜对其进行电镜扫描操作：将扫描样品均匀地分散后，将其滴在载玻片上，然后在喷金处理后进行扫描电镜观察，且在观察过程中注意其形貌及粒径的分布。
2.2 5-Fu磁性壳聚糖微球药物释放性能的测定
2.2.1 5-Fu标准曲线的测定
使用电子天平准确称量10mg的5-Fu置于100.00mL容量瓶中，用pH为6.86的磷酸缓冲溶液对其进行定容，然后准确地吸取(1mL、2mL、3mL、4mL、5mL)的上述溶液至50.00mL的容量瓶中，再分别用pH为6.86的磷酸缓冲溶液进行定容，即准确地配制浓度分别为(2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL)的5-Fu标准液。依次取上述5种不同浓度的溶液使用紫外可见分光光度计测定其于265nm处的吸光度。进行数据作图时以吸光度为横坐标、溶液浓度为纵坐标，然后以吸光度A对药物的质量浓度C(μg/mL)进行线性回归，即可求得5-Fu在pH为6.86的磷酸缓冲溶液中的标准曲线方程。
表2-3 实验数据
|
质量浓度（μg/mL） |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
|
吸光度 |
0.147 |
0.261 |
0.365 |
0.543 |
0.738 |
2.2.3微球载药量的测定
用电子天平称取8mg 5-Fu磁性壳聚糖微球，将其溶于适量的PH为6.86的磷酸缓冲溶液中，对其1h的超声操作，然后转移至50mL的容量瓶中，用缓冲溶液将其定容，然后进行过滤，使用紫外可见分光光度计测定其在265nm处的吸光度。按上述操作重复进多次，分别测量数据即得出其吸光度。
表2-4载药量测定的实验数据
|
实验次数 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
吸光度A |
0.084 |
0.081 |
0.081 |
0.082 |
0.086 |
0.084 |
0.085 |
求其平均值后将其代入其标准曲线算出5-氟尿嘧啶的浓度。载药量的计算公式：
载药量=5-氟尿嘧啶的质量/微球的总质量 (1)
2.2.3药物释放性能的测定
用电子天平称取20mg制备好的5-Fu磁性壳聚糖微球于透析袋中，使用细线将透析袋的两端扎紧。在锥形瓶中倒入10mL pH为6.86的磷酸缓冲溶液后将装有微球药品的透析袋放入锥形瓶中。然后将锥形瓶放置于37℃的恒温振荡器中振荡并记为反应时间， 待0.5h后，倒出透析袋中的缓冲溶液，并以磷酸缓冲液为标准液，使用紫外分光光度计测量缓冲溶液于265mm处的吸光度，然后在锥形瓶中加入新的10ml的缓冲液。重复同上的操作，距开始反应时间间隔依次为1.0h、1.5h、2.5h、4.5h、6.5h，分别测其条件下的吸光度。
表2-5 微球药物释放性能的测定数据记录
|
实验次数 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
时间间隔（hr） |
0.5 |
1 |
1.5 |
2.5 |
4.5 |
6.5 |
|
吸光度A |
0.075 |
0.047 |
0.028 |
0.023 |
0.015 |
0.013 |
2.3磁性壳聚糖微球生物相容性的研究
2.3.1 实验材料和仪器
在相容性评价实验中所用到的实验材料和仪器如下表所示。
表2-6 相容性实验原料
|
名称 |
规格 |
生产厂家 |
|
|
甘油 |
分析纯 |
天津市天丽化学试剂有限公司 |
|
|
二甲基亚砜 |
分析纯 |
天津市天力化学试剂有限公司 |
|
|
磷酸缓冲液 |
分析纯 |
上海虹北试剂有限公司 |
|
|
5-氟尿嘧啶 |
医疗及 |
西安瑞林生物科技有限公司 |
|
|
噻唑蓝（MTT） |
分析纯 |
成都艾科化学试剂有限公司 |
|
表2-7相容性实验仪器
|
名称 |
型号 |
生产厂家 |
|
|
细胞培养箱 |
DF101D |
巩义市予华仪器有限公司 |
|
|
紫外可见分光光度计 |
UV2100 |
美国 UNICO |
|
|
饱和湿度培养箱 |
FA2004B |
上海佑科仪器仪表有限公司 |
|
|
免疫酶标仪 |
OD90W |
北京京伟电器有限公司 |
|
|
离心机 |
802 |
金坛市城西春兰实验仪器厂 |
|
|
扫描电子显微镜 |
SU3500 |
日本日立高新公司 |
|
2.3.2 生物相容性的评价实验
实验从材料的细胞相容性和血液相容性这2个方面，运用MTT实验、溶血实验这两种方法来评价磁性壳聚糖纳米微球的生物相容性[17，18]
(1)体外细胞相容性实验
① 微球浸提液的配制：参照《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》所要求的方法，把磁性壳聚糖微球在紫外光照射下消毒，以含体积分数为10%新生牛血清的高糖DMEM培养基作为浸提介质，按照4g/L的浓度在条件为37℃、5%CO2的细胞培养箱中浸提72h，获得浸提液，然后在4℃无菌环境下密封保存。
② 0.5%MTT溶液的配制：准确称取MTT0.5g，将其溶于100mL的PBS中，使用0.22μm的滤膜进行除菌，然后将其放置于4℃、避光的环境中保存。特别注意的是，在进行配制和保存的过程中，所使用到的容器应用铝箔纸包住。
收集处于对数生长期中的细胞，对其进行常规消化后形成细胞悬液，并把其细胞浓度调节到6×104个/mL然后以每孔加入100μL细胞悬浮液的规格将其接种在96孔的培养板里，把每个浓度分别设置成3个平行孔，然后将其放置在37℃和5% CO2的饱和湿度培养箱中进行培养， 24h后弃去原液，再加入终浓度分别为1、2、3g*L-1的微球浸提液，分别对其继续培养24h、48h、72h后，再往每个孔里加入20μL的MTT，再进行4h的培养，之后小心吸去孔内培养液并弃之，每孔加入150μL 的二甲基亚砜(DMSO)，对其振荡10 min至晶体充分溶解，用免疫酶标仪测其在490nm处的吸光度。设置的空白对照组为：配制细胞和浓度都相同的微球浸提液介质、培养液、MTT以及二甲基亚砜(DMSO)。细胞的相对增值率限(RGR)的计算公式：RGR/%=实验组吸光度均值/空白对照组吸光度均值×100% (2)
(2)血液相容性实验
取2mL的兔血，然后加入往里0.1mL 20g/L的草酸钾溶液，同时按每4 mL加入5mL生理盐水的比例来配制稀释的新鲜血液。在配制得到不同浓度下的磁性壳聚糖浸提液后，分别取4mL不同浓度的浸提液，再加入0.1 mL的稀释血液，然后将各管放置于37℃恒温水浴中继续保温60min，将其放置在离心管中，并以2000 r/min的速率进行离心操作，待5 min后取每管的上清液，最后使用紫外分光光度计测定其各自在540nm波长处的吸光度。同理，采用4mL纯化水加入0.1 mL的稀释血作为阳性对照，采用4 mL生理盐水加入0.1 mL的稀释血作为阴性对照，然后分别测定其吸光度。阳性对照组的吸光度A=( 0.8 ± 0.3) ，阴性对照组的吸光度A≤0.03。实验数据如下表2-8所示：
表2-8血容性实验数据表
|
组别 |
吸光度 |
|
阳性对照组 |
0.815 |
|
隐形对照组 |
0.007 |
|
1g/L磁性微球浸提液 |
0.013 |
|
2g/L磁性微球浸提液 |
0.019 |
|
3g/L磁性微球浸提液 |
0.029 |
|
4g/L磁性微球浸提液 |
0.034 |
3 结果与讨论
3.1 5-Fu磁性壳聚糖微球载药量测定的结果
3.1.1 磁性壳聚糖微球的电镜扫描结果与分析
使用电子显微镜对实验所制备得的磁性壳聚糖微球的结构与形貌进行扫描观察，扫描结果如图3-1所示。
图3-1微球粒态扫描图
从扫描结果可看到，磁性壳聚糖微球的粒径在50.0μm左右，但其成球性稍差，而且分散性较差，局部甚至有团聚现象。 这种不良结果的产生或许是在进行制备磁性壳聚糖微球的洗涤操作时，没有将微粒彻底洗净，使微球表面还掺杂有油酸钠或油酸等一些油性杂质，导致微球表面因油性物质的存在而表面粘性增大而使微粒之间不利分散开来而产生了局部团聚现象的发生。
3.1.2 5-Fu标准曲线的测定
准确称量10mg的5-Fu放置于100.00mL容量瓶中，然后准确地配制浓度分别为(2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL)的5-氟尿嘧啶标准液。依次取上述5种不同浓度的溶液使用紫外可见分光光度计测定其于265nm处的吸光度。使用excel2010对表3-1中的实验数据进行数据处理可求得5-氟尿嘧啶在pH为6.86的磷酸缓冲溶液中的标准曲线方程。如图3-2所示：
图3-2 5-Fu在PH为6.86的磷酸缓冲溶液中的标准曲线
由图3-2所示，5-Fu的线性回归方程为：A=0.0732C-0.0284，R=0.9901。从图上可知，5-Fu在265nm处的吸光度会随着其质量浓度的增大而增大。但也发现了该曲线的斜率与理论值有些偏离，且当浓度为0时吸光度却为负值，这或许与实验所使用的5-Fu药品的纯度有关，即有可能5-Fu药品长时间暴露于空气中而变质;或许是在测量其吸光度时仪器自身不稳定导致测得的数值产生误差。
3.1.2 微球载药量的测定实验结果及分析
由表3-3中的数据得出吸光度平均值为0.08328，代入其标准曲线A=0.0732C-0.0284可求得此时5-Fu的质量浓度，最后代入载药量的计算公式即可得到微球的载药量。表3-3是微球载药量测定实验结果一览表。
表3-3 载药量测定实验数据
|
名称 |
数值 |
|
|
A的平均值 |
0.08328 |
|
|
5-Fu溶液的质量浓度（μg/mL） |
1.526 |
|
|
5-Fu溶液的体积（mL） |
50 |
|
|
5-Fu的质量（mg） |
0.07628 |
|
|
微球总药量（mg） |
8 |
|
|
载药量 |
0.95% |
|
从上表看出微球的载药量为0.95%，这个结果可知其载药量较少。由载药量的计算公式：载药量=5-Fu的质量/微球总药量知，载药量的大小与5-Fu的质量有关，即微球载药量受5-Fu的质量浓度的影响。所以，说明在进行5-Fu磁性壳聚糖微球的表征实验时，或许是因为在对5-Fu磁性壳聚糖微球进行洗涤操作时未能将微球表面的油性物质洗净，导致5-Fu磁性壳聚糖微球的表面被油性物质紧紧包裹而使5-Fu不能释放，或许是早在制备磁性壳聚糖微球时未能将其表面的油性物质洗净而使在制备5-Fu磁性壳聚糖微球时导致5-Fu被油性物质紧紧黏住而无法释放，从而使微球的载药量降低。
