第一章 绪论

　　1.1 枸杞简介

　　枸杞为人们对商品枸杞果、植物宁夏枸杞、中华枸杞等枸杞属下物种的统称，枸杞(拉丁名：Lycium chincnse Mill英文名：WolfBerry Extract)别名甘杞子、甘州枸杞果落叶灌木，可分为宁夏枸杞和中华枸杞两大类，枸杞的产区主要集中在西北地区，宁夏的枸杞最为著名，另外新疆、甘肃、青海等地的枸杞品质也很高。人们日常食用和药用的枸杞果多为宁夏枸杞的果实"枸杞果"，而且宁夏枸杞是唯一载入《2010年版中国药典》的品种，与琼珍灵芝、长白山人参，东阿阿胶并称为中药四宝。果实叫枸杞果，根皮名为枸杞根皮，两者均可入药，另外枸杞的叶子也可以入药，可以说枸杞是一味全身是宝的名贵的药材和滋补品。中医很早就有“枸杞养生”的说法。《本草纲目》记载：“枸杞，补肾生精，养肝……明目安神，令人长寿。”《神农本草经》记载：“枸杞久服能坚筋骨、耐寒暑，轻身不老，乃中药中之上品。”《本草纲目》记载 “枸杞果甘平而润，性滋补……能补肾、润肺、生精、益气，此乃平补之药。”经研究，枸杞具有：免疫调节、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、抗辐射损伤、调节血脂、降血糖、降血压、保护生殖系统、提高视力、提高呼吸道抗病能力、美容养颜，滋润肌肤等养生保健功效。

　　黄酮类化合物作为枸杞的主要功能性成分，具有多种生理及药理作用，其在抗氧化性、抗衰老、清除自由基等方面作用显著，还能起到降血压、降血糖、抗氧化延缓衰老、镇静消炎、防癌抗肿瘤等功效[1-3]，是枸杞中研究最多也比较成熟的一类化合物。

　　1.2 枸杞中黄酮类物质研究现状

　　1.2.1 黄酮结构和性质

　　黄酮类物质属于植物次生代谢产物，是以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类具有多种生物活性植物多酚类物质。其具有二苯酚基丙烷(C6-C3-C6)骨架，黄酮类芳环(A环、B环)之间通过一个三碳链(C环)相连接[4]。C环部分可以是脂链，也可以与B环形成氧杂环。因此根据C环部分的氧化程度的不同、成环程度的不同和B环连接位置的不同，可以将黄酮类化合物分为黄酮类和黄酮醇类、双黄酮类、二氢黄酮类和二氢黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类和其他等[5]。

　　黄酮类化合物多为晶体状固体形态，少数为不定形的粉末。黄酮苷一般可以溶于水、甲醇、稀乙醇、和乙酸乙酯等极性溶剂。其溶解度会因其结构和存在的状态(苷或苷元、单糖苷、双糖苷和三糖苷)不同而不同。一般情况，黄酮游离的苷元难于溶于水或者是不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等有机试剂及稀碱水溶液当中。黄酮类化合物分子能够与铝盐、镁盐、铅盐等生成黄色且具有荧光的络合物，根据这一性质可进行其定性和定量分析[6]。

　　图1.1 黄酮母核及结构骨架

　　Fig. 1.1 The main structural framework of flavonoids

　　1.2.2 枸杞黄酮功效研究现状

　　枸杞因含有大量的黄酮类化合物等有效成分，其保健功能在食品领域[7]和医药领域的作用一直是研究开发的热点，随着人们健康保养意识的提升，其抗氧化功效也逐渐被人所重视，并被越来越多运用于化妆品开发领域当中。

　　1.2.2.1 枸杞黄酮抗氧、清除自由基作用

　　枸杞中黄酮类物质含量很高而且种类丰富，黄酮在人体内具有强大的生物活性，由于黄酮的小分子及特殊的分子结构，其遇到自由基后会给出一个电子中和自由基，有效的清除自由基，且自身不形成能引发链锁反应的有害物质;黄酮与胶原蛋白有较强的亲和力，能形成一层抗氧化保护膜，保护细胞和组织不被自由基氧化。黄酮淬灭自由基的能力是Vc的20倍，VE的50倍[8-9]。

　　1.2.2.2 枸杞美容功效研究现状

　　在我国，枸杞一直都被视为健康养生的珍贵药材，同时在美容方面的功效也尤为突出，它可以抑制超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、和谷胱甘肽过氧化氢酶GSH-Px)失活，能起到很好的抗衰老以及抗氧化作用[10-11]。同时枸杞中含有大量大花青素类物质，能补充营养消除体内有害的自由基[12]，并能阻止紫外线对皮肤的伤害，因此枸杞也可算得上是很好的天然口服化妆品[13-14]。枸杞果实中的黄酮和酚类成分因具抗氧化、抗皱、美白、消除雀斑的作用，可用于化妆品生产。

　　1.3 枸杞黄酮的成分研究

　　目前，枸杞黄酮(Flavonoids)的具体成分还未完全测出。

　　董静洲等[15]采用色谱柱分离总黄酮和化学法鉴定主要黄酮是一种异黄酮。张自萍[16]建立了宁夏枸杞黄酮类化合物色谱指纹图谱，图谱16 个峰中的12 号和16 号为绿原酸和芦丁。李娜[17]从甘肃白银景泰枸杞黄酮浸膏中分离得到6 种化合物，它们是β-胡卜素，β-谷甾醇，金合欢素，木犀草素，芦丁。李淑珍[18]在黑果枸杞中利用薄层层析和高效液相色谱法鉴定出枸杞总黄酮中含有芦0.8870%、槲皮素0.0414%、木犀草素0.0411%、异鼠李素0.0258%和山奈素0.0448%等成分，共占总黄酮含量的37.14%。还有报道[19]称从枸杞地上部位分离鉴定了四种黄酮醇的三糖苷：槲皮素-7-0-葡萄糖-3-0-葡萄糖基(1-2)半乳糖苷;槲皮素-7-0-葡萄糖-3-0-槐糖苷;山柰酚-7-0-葡萄糖-3-0-葡萄糖基(1-2)半乳糖苷;山柰酚-7-0-葡萄糖-3-0-槐糖苷。邹耀洪等[20]在枸杞叶中分离出五种化学成分，分别为5, 7, 3′-三羟基-6, 4′, 5′-三甲氧基黄酮，金合欢素，金合欢素-7-0-α-L-鼠李糖基(1→6)-β-D-葡萄糖苷，木犀草素，芦丁。Kim Le 等在宁夏枸杞中分离出了枸杞黄酮(脱糖后)的三个成分并测定它们的含量：槲皮素(296 μg/g)，杨梅酮(247 μg/g)，山奈酚(135 μg/g)。这三种成分占总黄酮成分的43%。

　　综上所述，枸杞黄酮的具体成分可能包含以下几种：绿原酸、芦丁、金合欢素、槲皮素、异鼠李素、山奈素、木犀草素、杨梅酮等。

　　1.2.3 枸杞黄酮的利用与开发现状

　　枸杞作为我国传统的宝贵药材，由于其本身的降血糖、血脂、抗氧化、提高免疫力、抗癌等保健功效，一直备受人们的关注，近年来枸杞的应用价值随着枸杞中多糖以及黄酮类化合物的深入研究也得到了很大的提升，枸杞的综合利用产业链也逐渐形成，不仅在制药工业中受到重视，同时在其他领域的的应用研发也在逐步深入。在制药领域，由于枸杞安全无毒在抗炎、降血脂、保护细胞受损等功效非常显著，现在已有其制得的胶囊、片剂、冲剂用于临床治疗中。同时枸杞，符合现代社会的绿色、健康、自然的消费需求，现在在食品领域开发得最多的是作为枸杞类保健及功能性饮料[7]。在化妆品领域，现在市面上已出现了添加枸杞提取物的面膜，宣称其具有显著的保湿抗氧化等功效。

　　1.4 黄酮提取、分离方法研究

　　1.4.1 黄酮提取方法简介

　　目前，枸杞黄酮的提取有热水浸提法、碱液提取、有机溶剂提取法、乙醇加热回流法、超声波辅助提取法、超临界萃取法、微波法和酶法等。水提法是全物理过程无污染，但是提取杂质多，收率较低，提取液过滤、浓缩等操作困难且又费时。碱液提取法，是利用黄酮类含有酚羟基，呈弱酸性，不溶于酸性水而易溶于碱性水(如氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钙水溶液)，故可采用碱性水或碱性稀浸出，再对碱性提取液进行酸化，黄酮苷类即可沉淀析出;但碱液提取时，加热条件下强碱环境会破坏黄酮类化合物的母核，加酸酸化时，强酸环境会使其生成佯盐，析出的黄酮又会重新溶解，因此酸碱度的控制较为复杂。有机溶剂提取法中常用乙醇、甲醇或某些极性较大的混合溶剂进行提取;一般以高浓度的丙酮、甲醇、乙醇等有机试剂(如90%-95%的乙醇)来提取苷元，60%左右浓度的乙醇或甲醇水溶液适宜提取苷类物质;虽然有机溶剂对黄酮的提取率高，但大多溶剂都易燃易爆，多数有机溶剂具有强刺激性或者有毒，危害人体和污染环境，且提取时间较长。超声波提取法是利用超声波产生的机械作用、扩散、热效应以及空化作用，使液体内部产生强的冲击波和微射流，局部出现高温、高压，导致多重次级效应，从而加快体系的传质和传热速度，加强细胞内物质的释放，从而加速植物中有效成分的扩散和浸出;超声波的热效应有利于物质的溶解，因此，具有提取时间短，可以控制在一小时内，有效成分提取率高，成本低、低温保护热敏性成分、污染小等优点。

　　以乙醇加热回流法[21]应用最广，提取过程通常需要2h以上。微生物法[22]提取植物活性成分是利用微生物在生长过程中分泌的多种酶，从而对植物中的活性成分进行提取和修饰。微生物法不必使用有机试剂、温度适中、对环境无污染，更环保，更安全并且条件温和，能使细胞中释放出来的有效成分得到更好的保护，实现高效提取的目的。

　　1.4.2 黄酮分离纯化方法简介

　　柱层析法中分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有大孔吸附树脂、聚酞胺、纤维素、及硅胶等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。

　　1.4.2.1 大孔树脂纯化技术

　　大孔吸附树脂(maeroporous adsorption resin)是一种不含交换基团，具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，通过物理吸附从溶液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离提纯的目的。大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料。大孔吸附树脂的吸附性能是依靠它和被吸附分子之间的范德华力或生成氢键的结果，通过它巨大的比表面积进行吸附工作的;同时由于大孔吸附树脂的多孔性结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。通过吸附和筛选，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱儿达到分离。

　　大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的，近年来逐渐被应用于中草药化学成分的提取分离和中药新药的开发研制，具有吸附快、吸附容量大、洗脱率高、树脂再生简单等优点。

　　1.4.2.2 大孔树脂法分离纯化黄酮应用现状

　　大孔吸附树脂的性质和天然吸附剂活性炭相似，在某种程度上要比活性炭优越得多。大孔吸附树脂物理、化学稳定性高，机械强度好，耐用;吸附选择性好、富集效果好;无机盐存在时不仅不干扰吸附，而且有利于吸附;解吸条件温和;易再生，一般情况下，用水、稀酸、稀碱加低碳醇、酮等有机溶剂洗脱即可，节省费用;使用周期长;种类较多，根据具体需要不同可选择不同树脂品种，可适用于多种化合物;具有很强的脱色能力。因此，大孔吸附树脂被广泛应用于天然产物的分离纯化 。

　　关于黄酮类化合物的纯化分离，原多采用溶剂萃取法及离子交换树脂法等方法，但其溶剂残留量大，处理量小，需引入可进行交换的酸性或碱性基团，且提取率低。大孔吸附树脂分离纯化黄酮类化合物的研究中，研究学者通过比较，表明弱极性树脂对黄酮类化合物吸附量大，分离度好，解吸容易，总黄酮含量高。近年来，对大孔吸附树脂提纯黄酮类化合物也作了大量工主要有HP-20系列、DA201、DM103和HPD-100等树脂[23-24]。其中以HPD0-100树脂表现最好，95%乙醇解吸效果较好。弱极性树脂对黄酮类化合物具有良好的吸附性能的原理是：黄酮类化合物极性较小，分子中有较多的酚羟基和糖苷链，可以和树脂骨架分子形成氢键：而HPD-100大孔树脂的孔径在1.30-1.40μm之间，其网状结构则比其它树脂更适合黄酮类化合物的分离。

 

1.5高效液相色谱法法检测黄酮方法研究

　　(High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 又称“高压液相色谱”，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC 具有高压、高效、高灵敏度及应用范围广的特点。从而再枸杞黄酮的分离以及结构鉴定中得到了广泛的应用。董静洲等对宁夏枸杞果实黄酮提取液进行色谱柱分离，并对我国宁夏枸杞六大产区的枸杞果实总黄酮提取液进行了杞样品进行了分析[7]。

　　1.6 枸杞黄酮抗氧化活性研究

　　1.6.1 自由基概述

　　机体中的氧浓度高于或者低于机体的正常水平范围，都会对机体产生自由基损伤。活性氧包括超氧阴离子(02-)、过氧化氢(H202)、羟基自由基(·0H)、有机过氧基(ROO·)、脂质过氧化物(ROOH)以及氮氧自由基等。这些活性氧自由基一旦诱发产生就是连锁反应，它们能对生物体产生一系列的毒害作用而引起细胞损伤，只有遇到自由基清除剂才能终止自由基反应。

　　自由基生物学和自由基医学研究表明，如进攻不饱和脂肪酸，可引起脂质过氧化，导致生物膜结构和功能的改变，损伤蛋白质的巯基和氨基，可使蛋白质变性、交联，使酶的活性丧失;损伤DNA可导致基因突变。活性氧自由基诱导的LPO反应与炎症、糖尿病、高血脂症、癌症等许多疾病的发生有密切的关系生物体内活性氧生成与清除的这种平衡对生命过程的正常进行显得十分重要。中草药是巨大的天然抗氧化剂来源，黄酮类化合物具备一定的抗氧化作用，能清除体内超氧阴离子、羟基基自由基、过氧化氧及其他活性氧的作用，从而达到抗衰老作用。

1.6.2

抗氧化性检测方法

　　抗氧化剂的抗氧化活性主要表现在抑制脂质(也可以是蛋白质或DNA)的氧化降解、清除自由基、抑制促氧化剂(如螯合过渡金属)和还原能力等几方面。各种方法测的都是抗氧化活性的一个方面。抗氧化活性的检测模式主要有：测量底物(标记底物)或产物的量的变化;测量氧化反应的速率;测量特征自由基变化的速度或程度;测量被测物的抑制率，IC50和TIC50;测量被测物产生与标准抗氧化剂同等作用的浓度。

　　抗氧化剂在体系中的抗氧化活性会受到很多因素的影响，主要有抗氧化剂所处的微环境、水相和油相间的分配效应、被氧化底物的性质和组成和检测体系等。因此，在进行抗氧化活性实验设计时，这些因素都要被考虑。本文采用的是DPPH自由基清除能力检测方法。

　　生物体中存在的自由基：超氧自由基(O2-·)，过氧化氢(H2O2，过氧自由基(ROO-)，羟自由基(HO·)，单线态氧1O2和过氧化氮自由基(ONOO-)等。其中，单线态氧和过氧化氢并非自由基，而是类似自由基的活性氧，也会对机体产生破坏作用。

　　自由基的清除是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机制。稳定的色原体自由基(如DPPH·)在有机体系中已被广泛用于抗氧化活性的检测。以清除自由基测定抗氧化能力的方法，是目前最流行、使用最多的方法，因为其简便、快捷。

　　DPPH自由基的清除能力测定。DPPH法最初用于研究食物中的供氢体，后来广泛用于定量测定生物试样、酚类物质和食品的抗氧化能力。DPPH·(二苯代苦味酰基自由基)在有机溶剂中是一种稳定的自由基，并在517nm处有一强吸收，其乙醇溶液呈深紫色。当由自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，通过比色法可测定自由基清除剂的清除能力[25-26]。

　　1.7 本课题的提出、研究目的意义和内容

　　1.7.1 课题的产生和立题依据

　　现今已证明的枸杞的功效，枸杞黄酮是枸杞的重要的功效成分之一，我认为枸杞在化妆品领域的运用前景还很广阔，如它显著的清除自由基的功效，可开发出枸杞的抗衰老系列的产品;它对酪氨酸酶强烈的抑制作用，可用于开发美白淡斑类产品;它的抗炎功效也可以应用于祛痘产品以及敏感肌的修复等。因此，测定出枸杞黄酮类化合物的具体组分，用以确定针对性地提取枸杞中的黄酮类活性成分的提取方法，对推动枸杞类类化妆品产品开发和产业化具有重要积极的作用。

　　1.7.2 课题研究内容

　　枸杞是一种丰富的天然资源，研究已经证实果实和根皮中含有众多的活性有效成分，特别是主要有效成分黄酮类化合物，具有广泛的开发应用前景。本课题对微生物法提取枸杞黄酮，以及大孔树脂法分离和纯化的工艺进行了简单的优化，利用高效液相色谱法液相色谱法检测枸杞叶黄酮，并比较了乙醇浸提法和微生物提取法提取的枸杞黄酮的活性，为确定针对性地提取枸杞中的黄酮类活性成分的提取方法，对推动枸杞类类化妆品产品开发和产业化奠定理论基础。

　　枸杞通过微生物发酵法进行总黄酮提取。

　　枸杞提取物通过大孔树脂进行分离纯化，通过筛选树脂和静态吸附优化纯化工艺，得到枸杞总黄酮粗品。

　　建立高效液相色谱检测黄酮方法，并通过该方法可以检测枸杞黄酮的主要成分。

　　通过通过DPPH·的清除能力试验测定枸杞黄酮的抗氧化活性，比较微生物提取法和乙醇提取法提取的枸杞黄酮的抗氧化能力。