第2章 枸杞黄酮的提取、分离、纯化研究

　　以宁夏枸杞以及枸杞根皮作为实验材料，以枸杞果和枸杞根皮中的黄酮类化合物的含量为考察对象，通过微生物提取法和乙醇提取法分别对枸杞果和枸杞根皮中的黄酮类化合物进行提取，筛选出最优的发酵菌种，为深入研究枸杞果和枸杞根皮中的黄酮类化合物奠定基础。

　　2.1 实验材料

　　2.1.1 材料、试剂

　　2.1.1.1 菌种　5种酵母，购自北京市食品酿造研究所。

　　2..1.1.2 供试材料　枸杞购于中国宁夏。

　　2.1.1.3 试剂　 芦丁分析纯标准品98%，阿拉丁试剂(上海)有限公司; DPPH (1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)购自美国Sigma 公司;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为市售国产分析纯;酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨;水为去离子水。

　　2.1.2 仪器、设备

　　ZN-04B小型粉碎机，北京兴时利和科技有限公司;匀浆机，飞利浦有限公司;TB-2002电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司;超净台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司;高压灭菌锅(上海申安医疗机械厂)、全温度振荡培养箱(太仓华美生化仪器厂)、水浴恒温摇床(太仓华美生化仪器厂)、低速大容量台式离心机等。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 对照品溶液及供试品溶液的制备

　　供试品的制备：取枸杞60℃干燥至恒重。

　　YPD液体培养基的配制：精确称取1g酵母浸粉，2g蛋白胨，2g葡萄糖加入250ml锥形瓶中，补去离子水至100ml刻度线，摇匀。

　　芦丁对照的制备：准确称取恒重芦丁标准品50mg，溶于50mL 的超纯水，制得1mg/ml 的标准溶液。准确配制 1 mg / mL 芦丁标准液。

　　微生物提取供试液制备：

　　60℃干燥恒重枸杞果取→ 5 g 枸杞果→ 按照 1∶20的料液比， 加入去离子水 100 mL，→于榨汁机中打成匀浆→121℃高压灭菌锅中灭菌30min →待冷却，按5%的接菌量接入菌种，→180rmp, 28 ℃的空气摇床中提取 48 h→4 000 r / min 离心 10 min→取上清液作为供试品溶液待测。

　　60℃干燥恒重枸杞根皮→50目过筛备用。2g 枸杞根皮粉末→ 按照 1∶50的料液比， 加入去离子水 100 mL，→121℃高压灭菌锅中灭菌30min →待冷却，按5%的接菌量接入菌种，→180rmp, 28 ℃的空气摇床中提取 48 h→4 000 r / min 离心 10 min→取上清液作为供试品溶液待测。

　　乙醇提取供试液制备：

　　60℃干燥恒重枸杞果取→称取 5 g 的枸杞果→按照 1∶20料液比(g∶mL，下同)， 加入体积分数为 75%的乙醇100mL→于榨汁机中打成匀浆→70 ℃ 160rpm 水浴摇床提取3 h→冷却→4 000rpm 10 min离心取上清液作为供试品溶液待测。

　　60℃干燥恒重枸杞根皮→50目过筛备用。2g 枸杞根皮粉末→ 按照 1∶50的料液比， 加入乙醇 100 mL，70 ℃ 160rpm 水浴摇床提取3 h→冷却→4 000rpm 10 min离心取上清液作为供试品溶液待测。

　　2.2.2 总黄酮的测定

　　硝酸铝络合分光光度法测定总黄酮

　　硝酸铝络合分光光度法测定总黄酮的原理为:在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下,黄酮类化合物与铝盐生成螯和物,加入氢氧化钠溶液后显红橙色,在510nm波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律，即可用紫外分光光度计在510nm波长下测定吸光度进行定量分析。

　　2.2.2.1 标准曲线的绘制

　　准确称取恒重芦丁标准品50mg，溶于50mL 的超纯水，制得1mg/ml 的标准溶液。准确配制 1 mg / mL 芦丁标准液，精确吸取 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 芦丁标准液，补齐至 1 mL，各加入 0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置 6 min，加入 0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置 6 min，加入 4 mL 1 mol / L NaOH 溶液，再加 0.4 mL 去离子水，摇匀，放置 10 min，以空白试剂为对照，在 510 nm 处测吸光值A。

　　2.2.2.2 样品总黄酮含量的测定

　　准确吸取样品1ml置于试管中，加入 0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置 6 min，加入 0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置 6 min，加入 4 mL 1 mol / L NaOH 溶液，再加 0.4 mL 去离子水，摇匀，放置 10 min，以空白试剂为对照，在 510 nm 处测吸光值A

　　按2.2.2.1节标准曲线的绘制项下的回归方程计算供试品液中总黄酮质量浓度，并计算样品总黄酮提取率。

总黄酮提取率：X/(%)=

　　式中：n为提取液稀释倍数;C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL;V为提取液体积，mL;m为提取时所加原料质量，mg;X总黄酮提取率;样品含量换算成mg/g(芦丁当量)表示。

　　2.3 结果与讨论

　　2.3.1 不同菌种对枸杞果黄酮提取率的影响

　　图2.1 不同菌种对枸杞果黄酮的提取率

　　由图2.1可知2号菌对枸杞果黄酮的提取率最高，提取率为0.649%。

　　2.3.2 不同菌株对枸杞根皮黄酮提取率的影响

　　图2.2 不同菌株对枸杞根皮黄酮的提取率

　　由图2.2可知2号菌对枸杞根皮黄酮的提取率最高，提取率为8.235%。

　　2.3.3 微生物提取法和乙醇提取法对枸杞子黄酮的提取率的影响

　　2.3.3.1 微生物提取法和乙醇提取法对枸杞子黄酮的提取率的影响

　　图4.5 微生物提取法和乙醇提取法对枸杞子黄酮的提取率

　　由图4.5可知乙醇提取法对枸杞子黄酮的提取率比微生物提取法高出0.02%。

　　2.3.3.2 地骨皮黄酮微生物提取法和乙醇提取法提取率比较

　　图4.6 微生物提取法和乙醇提取法对枸杞根皮黄酮的提取率

　　由图4.6可知乙醇提取法对地骨皮黄酮的提取率比微生物提取法高出1.2%。

　　2.4 小结

　　在2.2.1节设定的实验条件下，以枸杞黄酮提取率为标准，以硝酸铝络合分光光度法测定总黄酮含量，由2.3的结果分析可知，菌种对枸杞果及枸杞根皮黄酮的影响并不大，但是还是可以确定选取的五种菌中提取枸杞果黄酮以及枸杞根皮黄酮的最优菌种为2号菌，提取率分别为0.649%和8.235%;可看出乙醇提取法对枸杞果黄酮和枸杞根皮黄酮的提取率较微生物提取法对枸杞果黄酮和枸杞根皮黄酮的提取率分别高出0.02%、1.2%。

第

　　天然植物中所含有的黄酮类化合物种类众多、成分复杂、含量较低，并具有多种多样的生物活性，因此从天然植物中分离纯化黄酮类化合物极具重要性和挑战性[27-28]。跟据以往研究得知，绿原酸、芦丁、槲皮素、异鼠李素，山奈酚，和杨梅酮(Myricetin，MY)可能是是枸杞中六种主要的黄酮类物质[29]。

　　传统的分离纯化黄酮类化合物的方法有液-液萃取法、柱色谱法(硅胶柱，聚酰胺柱和葡聚糖凝胶柱等)、大孔吸附树脂、制备\半制备型液相色谱法等，还有气质联用法(gas chromatography with mass spICtrometry，GC-MS)，高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)和液质联用法(HPLC combined with mass spICtrometry，HPLC-MS)已经用于分离和鉴定枸杞中的黄酮类物质[30-31]。

　　大孔吸附树脂有吸附性能好、吸附效率高、树脂再生容易等优点，常用来提取中草药化学成分[32]。近年来，对大孔吸附树脂提纯黄酮类化合物也作了大量工作，主要有聚酰胺、ADS-7、D1300、HPD-100、HPD-400等树脂[33-34]。

　　参考张崇坚[29]等的研究选用以上5种大孔吸附树脂对枸杞叶黄酮的提纯作比较试验，采用紫外-可见分光光度法，以不同大孔树脂对枸杞叶黄酮的吸附率、解吸率为评价指标，通过考察树脂类型、绘制树脂静态，综合评判确定最优工艺，并选取HPD-100吸附树脂做枸杞黄酮提纯应用试验。应用高效液相色谱法对初步纯化的莓叶黄酮进行分离与测定。

　　3.1 试验仪器、材料与试剂

　　3.1.1 实验仪器

　　紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司;旋转蒸发仪，RE-301，上海互佳仪器有限公司;泵，SHZ-CD型循环水真空泵，上海贝伦仪器设备有限公司。

　　色谱系统：Waters Empower色谱系统由Waters 1525二进制高效液相色谱泵、Waters 2707自动进样系统、Waters 2489 UV/VIS检测器和Empower 软件、Windows XP系统进行数据收集处理。

　　3.1.2 试剂药品

　　标准物质(纯度>97%)，即：儿茶素、芦丁、槲皮素、山奈酚和杨梅酮，购于阿拉丁试剂公司(中国上海)。甲醇为色谱纯级别，购于美国Fisher Chemical公司。超纯水通过Mili-Q水微乳净化系统(Milford，USA)获得，配制的溶液都需要通过0.45μm的膜(Millipore，USA)进行过滤，以此来保证流动相中无杂质。乙醇、盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯。聚酰胺、ADS-7、D1300、HPD-100、HPD-400树脂，北京迪朗生化科技有限公司。

　　3.2 方法

　　3.2.1 大孔树脂分离纯化方法

　　3.2.1.1 树脂的预处理

　　1.以0.5BV的乙醇浸泡树脂24h(1BV为1个树脂床体积)。

　　2.用2BV的乙醇以2BV/h的流速通过树脂柱，并浸泡树脂4～5h。

　　3.用乙醇2BV/h的流速洗涤树脂，至流出液加水不呈白色混浊为止，再用水以同样流速洗净乙醇。

　　4.用2BV的5%HCl溶液以4-6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡树脂2-4h，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。

　　5.用2BV的2%NaOH溶液以4-6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡树脂2-4h，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。

　　3.2.1.2 枸杞总黄酮提取物的制备按照

　　2.2.1 方法操作，提取枸杞黄酮。

　　3.2.1.3 黄酮含量的测定

　　按照2.2.2.2方法操作，测定并计算总黄酮的含量。

　　3.2.1.4 树脂的筛选静态吸附

　　取五种种处理好的大孔树脂各2g，分别加入枸杞果提取溶液50mL，放置于室温摇床中，每30分钟分别取各树脂吸附后的溶液于510nm处测定吸光度，计算室温下各种树脂对枸杞叶黄酮的吸附量(mg/g)和吸附率(mg/g)。

　　静态吸附容量Q=

　　式中Q—吸附量，mg/g;C0—枸杞果提取液总黄酮初始浓度，mg/mL;C1—吸附后溶液中剩余总黄酮浓度，mg/mL;V—溶液体积，mL;m—树脂质量，g。

　　吸附率e=×100%

 

3.2.1.5 树脂的筛选静态解析

　　枸杞果提取溶液于510nm下测定吸光值，作为初始值。通过大孔吸附树脂在一定时间静态吸附，静态吸附后的树脂过滤抽干，加50ml 95%乙醇解吸，置于温室摇床中，开始计时一定时间内，间隔10分钟取解吸液1mL，于510nm处测定吸光值，计算各种树脂对枸杞果黄酮的解析率(%)。

解析率e=×100%

　　3.2.1.6 数据处理

　　所有数据采用Excel 2003计算机软件进行统计处理。

　　3.2.2 高效液相色谱法

 

3.2.2.1枸杞果黄酮的简单纯化

　　取黄酮含量为0.6 mg/mL黄酮溶液1000ml，准确称取经40g预处理过的HPD-100树脂，在25℃下恒温振荡吸附5h。以95%乙醇为洗脱剂，进行静态洗脱2小时。解析液用旋蒸仪在45℃旋转频率120 r/min的条件下旋转蒸发至原体积的1/50→在45℃条件下枸杞黄酮浓缩液用烘箱烘干成黄酮固体化合物待用。

　　3.2.2.2 色谱条件[35]

　　Spherisorb C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm， 5μm);检测波长368nm,流动相：甲醇-水(60∶40)，流速为1.0 mL/min;进样量为10μL。

　　流动相甲醇，流动相配制好后超声波水浴30分钟，后用0.45 μm滤膜过滤。

　　3.2.2.3 枸杞样品制备

　　枸杞果黄酮提取物干燥称至恒重。准确称重三份5g冷冻干燥后的实验材料，加20mL 95%甲醇，超声15min后静置室温，过滤保留滤液，用95%甲醇定容至100mL。精密取1mL，用甲醇定容至10mL，配置成5mg/ml的样品液，在检测前通过0.45μm 滤膜进行过滤，待用[103]。

　　3.2.2.4 标准溶液的制备

　　精密称取真空干燥至恒重的标准品绿原酸、芦丁、槲皮素、异鼠李素、山奈酚和杨梅酮各0.0200g，分别加甲醇超声溶解后，转移至10mL容量瓶中，定容，摇匀，配制成2.00mg/mL储备液。分别取6种标准储备液2mL，混合后超声混匀制成混合标准液，标准溶液在检测前经0.45μm滤膜进行过滤。