1绪论

1.1万古霉素简介：

中文名称：万古霉素

外文名称：Vancomycin

分子式：C66H75Cl12N9O24CAS

分子量：1449.2635

结构式如图

万古霉素化学结构式

万古霉素为三环糖肽类抗生素[1-3]，属速效杀菌剂，临床上主要用于严重革兰阳性菌感染，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄糖球菌（MRSA）、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌（MRSE）所致的感染[4]。目前认为万古霉素安全有效浓度范围为峰浓度25～40mg/L，谷浓度为5～15mg/L[5]。血药峰浓度大于50mg/L，谷浓度大于10mg/L者为中毒范围[3]，可出现肾、听力损害等不良反应。所以对患者进行万古霉素的血药浓度监测尤为重要，临床上要常规做万古霉素血药浓度监测来实现患者给药的个体化，使血药浓度维持在安全的有效范围内，保证用药安全性和有效性的同时，降低耐药菌产生的机率。

高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度准确性高、灵敏度高，按照色谱条件操作后，出峰情况较理想，色谱分离比较彻底，精密度与回收率都比较好，但其操作需要专门的仪器及耗材，对试验者的自身要求也较高，需要避免流动相、沉淀剂等对血清样品的干扰，操作复杂，试验时间较长。化学发光酶免疫分析法是一种有效的微量和痕量分析法，用化学发光剂直接标记抗原或者抗体，根据化学发光体系中光子发光强度的大小，测定微量的抗原或抗体；AxsYM高效能全自动免疫分析仪

在检测的过程中采用全自动精确的加样系统、恒温系统、试剂冷藏系统、超声波清洗系统、磁场分离系统和中心数据处理系统等，在减少试验误差的同时，也提高检测速度。化学发光酶免疫法可同时大量地对同种药物的血药浓度进行监测，节约时间，提高医院工作效率，但是需要专门的试剂盒，检测成本较高。本试验结果显示，两种方法无显著性差异，虽然各有优缺点，但两者具有较好的相关性，测定结果并不需要相互校正，在临床治疗药物监测工作中可以根据监测要求和监测目的灵活运用。

张文娟、宋新文等采用固相萃取高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度，

以C18柱(Hypersil C18 4.6 mm×200 mm，10μm)为色谱柱，流动相为乙腈一磷酸二氢钾缓冲液(9：91)，流量为0.8 mL·min-1，检测波长为236nm；血浆样品上固相萃取(SPE)柱，以10％冰乙酸甲醇溶液为洗脱剂，在65℃水浴下氮气吹干后进样测定。结果万古霉素血浆样品线性范围为0.92～117．28mg·L-1，低、中、高3种不同浓度(4.69，23.45，46.90 mg·L-1)方法回收率别为100.92％，101．48％，104.31％，日内、日间RSD均小于5％；

王维忠、钱南萍等采用的是高效液相色谱法和化学发光酶免疫法测定万古霉素的血药浓度，比较两种方法测定万古霉素血药浓度差异，结果表明两种测定方法测定值相关性良好，r=0.9781.两种测定方法并不需要相互校正，临床治疗药物监测工作中可以根据监测需求和监测目的灵活应用。

杨林、殷永红、吴文兵等通过建立高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度，测定ICU 病房7 例肺炎合并呼吸衰竭( 或心力衰竭) 患儿的万古霉素血药浓度，结果平均峰质量浓度为( 22.10±13.65) μg /mL，平均谷质量浓度为( 10.60 ± 8.86) μg/mL。说明血浆万古霉素血药浓度个体差异较大，临床在使用万古霉素时有必要进行血药浓度监测，以调整给药方案，最大限度地减少万古霉素的耳、肾毒性。

1.2高效液相（HPLC）原理

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

1903年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromatography）和“色谱图”（Chromatogram）的概念。茨维特使用色谱法 chromatography （来自希腊字， chroma 意思是颜色， graphy 意思是记录 - 直译为颜色记录）来描述他的彩色试验。（令人好奇的是, 俄罗斯名字茨维特意思是颜色。）[11]  他在论文中写到：

“（原文）一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样，称之为色谱图。”

1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。

1952年，英国学者Martin和Synge 基于他们在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气－液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技术向前推进了一大步，这是气相色谱在此后的十多年间发展十分迅速的原因。

1958年，基于Moore和Stein的工作，离子交换色谱的仪器化导致了氨基酸分析仪的出现，这是近代液相色谱的一个重要尝试，但分离效率尚不理想。

1960年中后期，气相色谱理论和实践发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。

1970年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。

1990年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因组计划，蛋白质组学有HPLC作预分离等。

1.3高效液相（HPLC）特点

高效液相色谱法有“四高一广”的特点：

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

2 实验内容

2.1  仪器与试剂

2.1.1仪器

岛津高效液相色谱仪（包括LC-20AB泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20A柱温箱，SPD-20AV紫外检测器，LC-Solusion工作站）；HMS-350漩涡振荡器；AB265-S分析天平(瑞士梅特勒 ) ；PHSJ-5PH计（上海精科）；TGL-16G离心机 (上海安亭)。

2.1.2试剂

万古霉素对照品（中国药品生物制品检定所，批号130360—200301）。乙腈为色谱纯（UN1230）；磷酸二氢钾、磷酸、高氯酸均为分析纯，水为超纯水。

2.2  实验方法

反相高效液相色谱：反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系(正相色谱)相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。 反相色谱法适于分离非极性、极性或离子型化合物，大部分的分析任务皆由反相色谱法完成。

2.2.1 色谱条件

色谱柱： VP- ODS C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：乙腈-KH2PO4溶液（pH=3.2）（9：91）；流速：1.0 ml/min；检测波长：236 nm；进样量10ul；柱温：25℃ 。

2.2.2  溶液的配制

1）对照品储备液：精密称取万古霉素对照品24 mg置于5 mL的容量瓶中，用超纯水溶解并且定容，得到4.8 g/L的万古霉素对照品储备液，在4 ℃环境下冷藏备用。

2）精密称取磷酸二氢钾6.805 g，溶于1000 mL超纯水中，用磷酸调pH值至3.2，配制成0.05 mol/L 的磷酸二氢钾缓冲溶液。

2.2.3 血浆标准曲线的配制

分别精密吸取万古霉素贮备液0.03、0.06、0.12、0.25、0.5、1.0 mL，置于5 mL容量瓶中，用超纯水水稀释至刻度，制成质量浓度分别为28.8、57.6、115.2、 240、 480、960 mg/L的系列对照溶液，精密吸取各对照品溶液20 μL，置于1.5 mL的 Eppendorf 管中，分别精密加入180 μL的空白血浆，即得与系列对照品溶液质量浓度相同的含药标准血浆。

2.2.4 样品处理与测定

精密吸取200 μL空白血浆于1.5 ml Eppendorf 管中，加入200 μL 5% 高氯酸，旋涡混匀1 min，13000 r/min 离心12 min，取上清液10 μL进样分析，记录色谱图。

3 结果与讨论

3.1 方法专属性

在“2.2.1”项色谱条件及样品预处理方法进行操作，测定空白血浆、对照品、空白血浆加对照品的色谱图，记录色谱图。结果空白血清在对照品溶液色谱图中的吸收峰相应时间处(12 min)无色谱峰，表明血清杂质不干扰万古霉素的测定，见图1、图2、图3。

 

图 1.空白血浆

Figure 1.Blank serum

图 2 万古霉素

Figure 1.Vancomycin

图 3空白血浆+万古霉素对照品

Figure 3. Blank serum+vancomycin.

3.2  标准曲线

测定标准曲线的样本，按照样品预处理进行操作，取10μL进样测定，记录色谱图，以样品的质量浓度照拟 (C)为纵坐标、峰面积(A)为横坐标进行回归方程：Y=2017.9X+87.337  R2=0.9994。结果显示：万古霉素在2.88mg/L～96mg/L范围内成良好的线性关系。

3.3 提取回收率实验

分别精确配制质量浓度为20mg/L的血浆样品各3份,按“2.2.3”方法处理并进样，记录万古霉素的峰面积，并分别与相应浓度的对照品峰面积相比得到绝对回收率，血浆样品的提取回收率(n=3)为55.49%。

3.4 方法回收率实验

分别准确配制质量浓度为2.88，11.52，48 mg/L的血浆样品各3份，按样品预处理方法，用标准曲线回归方程计算样品的质量浓度，与加入量比较，得到低、中、高3种质量浓度的回收率，分别为125.8%、98.3%、115.7%。

3.5  精密度实验

取对照品溶液(48mg/L)10μL ，按照拟订色谱条件进样测定，连续进样6次。结果峰面积的RSD为0.93％，表明仪器精密度良好。

3.6 讨论

3.6.1 检测方法的选择　

关于血浆中万古霉素浓度的测定主要有HPLC法、酶免疫法、荧光偏振免疫法, 采用酶免疫法和荧光偏振免疫法测定时万古霉素的代谢产物会有干扰, 使测定值偏高[6] 。本研究采用HPLC法, 具有简便、高效、快速、灵敏的特点。

3.6.2 检测波长的选择

关于万古霉素的测定，国内大多数文献选择波长为236nm[7]。   

3.6.3 样品前处理条件优化        

万古霉素为亲水性大分子物质，其提取方法有蛋白沉淀法[8-10] 和固相萃取法。常用的蛋白沉淀剂有乙腈、硫酸锌、高氯酸、三氯醋酸、甲醇等。本实验曾采用10%硫酸锌、10％高氯酸酸、5％高氯酸和10%三氯醋酸作为蛋白沉淀剂，发现高氯酸处理血样的蛋白沉淀紧实，易于离心分离且上清液澄明，沉淀剂加入量少，提取回收率较高且稳定,虽然高氯酸有一定的氧化性，但是对万古霉素结构无破环，不影响含量测定。10%的硫酸锌作沉淀剂离心后，上清液有浑浊现象，而且在高校液相色谱仪上未能将检测出万古霉素吸收峰。10%三氯醋酸本身有很大的吸收，对万古霉素的检测造成干扰。故实验最终采用5％高氯酸为沉淀剂，且高氯酸的浓度较低有利于保护色谱柱。

本实验还对血浆和沉淀剂的体积比进行了优化，分别考察了血浆与5%的高氯酸体积比为1:1, 1:1.5 和 2:1对实验结果的影响，实验结果表明：血浆和沉淀剂体积比（1：1）和（1：1.5）时，对提取率的影响不大，分别为55.49%和55.76%。当血浆和沉淀剂体积比是（2：1）时，发现血浆中的蛋白沉淀不完全，最后选择体积为等体积比，且大多数文献采用的都是等体积比。