第1章 文献综述

1.1 丙酸简介 

1.1.1丙酸的理化性质

丙酸（Propionic Acid, PA）是一种有较强刺激性气味的无色透明的液体[1]，当在空气中的体积含量达到0.003％的时候，人体就可感觉到，可以以任意比例溶于水和乙醇等溶剂，有羧酸的典型的化学性质，分子式C3H6O2，空间结构如图1.1。其化学性质与低碳羧酸的典型化学性质相同，而丙酸的盐、酰胺、酯、酰氯和酸酐等较易得到，用通常的方法就可以制备[2]。

图1.1丙酸分子的空间结构

Fig.1.1 The spatial structure of PA molecular

丙酸的主要理化性质指标如表1.1。 

表1.1 丙酸的理化性质

Table1.1 Physical and chemical properties of PA

指标	数值
分子量	74.08
熔点（℃）	-22
沸点（℃）	140.7
相对密度（水=1）	0.99
相对密度（空气=1）	2.56
蒸气压（kPa/℃）	1.33/39.7
在水中可溶性	易溶
粘度	10 m Pa.S

1.1.2丙酸的用途

丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于动物饲料防腐、食品防腐、农业除莠剂合成、香料中间体合成、医药中间体合成、有机合成中间体等方面[3]。

动物饲料防腐剂（新鲜的粮食谷物含水量较大，使用丙酸钙作防腐剂，既能防腐、防结块，还能防止蛋白分解，保持营养成分）；

食品防腐剂[4]（ 面包、糕点等食品中添加丙酸钠也能起到很好的防腐作用；将约0.5%的丙酸钙添加在酱油中，能起到很好的防霉效果，夏天存放90天不发霉）；

农业除莠剂（由丙酸合成的2-氯丙酸和2，2-二氯丙酸钠，作为农业除莠剂能起到很好的除莠效果）；

香料中间体（ 用丙酸可以制取香料丙酸异戊酯、芳樟酯、丙酸香叶酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸卞酯、丙酸草兰酯、丙酸匀樟酯等，进而用于食品、化妆品；丙酸和异戊醇合成的丙酸异戊酷可作为香精合成的中间体，也可用作人造花精油的合成，）；

医药中间体（在医药领域，以丙酸为原料可制得丙氨酸[5]，进而生产维生素B6。我国是维生素B6的生产大国，每年在此项用途上需进口丙酸7000-8000吨。含丙酸钙15％的散剂和12.3％的软膏或溶液，可用于治疗寄生性霉菌引起的皮肤疾病。丙酸盐是大环内酯类抗生素如沙霉素、利福霉素、M-90等生物合成的重要前体）；

有机合成中间体（ 由丙酸合成的丙酸甲酯、3-氯丙酸、丙酸乙酯、3-氯丙酸氯、等都可以作为有机合成的中间体）；

合成丙酸纤维素（由丙酸合成的醋酸丙酸纤维素，可用于电视机、汽车零件等方面）。随着农业、轻纺、食品、医药等工业的发展，对农药除草剂、涂料杀菌剂、食品保护剂及饲料添加剂等的需求量日益增加，丙酸需求量也在日益增加[6]。

1.1.3丙酸的合成方法

当前丙酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，其中工业生产方法主要是化学合成法[7]。

(1) 化学合成法

化学合成法是以石油等化工产品为原料，经过加温、加压利用催化剂合成丙酸的方法，该方法是工业级规模上丙酸的主要生产方法[8]。常用的化学合成法有丙醛氧化法、轻质烃氧化法、乙醇羰基化法、乙烯羰基化法法、丙烯腈法等。其中丙醛氧化法最为成熟，在国外被普遍应用[9]。

丙醛氧化法此工艺包括丙醛生产和丙醛氧化两步[10]。通常采用乙烯加氢醛化法生产丙醛，目前有钴催化剂高压碳基化法和钉催化剂低压碳基化法两种。高压碳基化是在20-28MPa，130-150℃条件下进行，由于丙醛部分加氢成丙醇，丙醛收率较低。低压碳基化是在2MPa和100℃条件下进行，醛类可直接从反应混合物中蒸出，其质量分数达99％。丙醛在40-45℃下用锰作催化剂，发生自由基氧化反应生成丙酸。该氧化反应条件温和，转化率高，选择性好，腐蚀较轻且不需高压设备，适用于大型装置。美国丙酸产量的90％以上是用丙醛氧化法生产的[11]。

(2) 微生物发酵法

微生物发酵法是丙酸菌在常温、常压下利用一般营养源通过自身代谢产生丙酸[12]。微生物发酵法能够利用可再生资源，生产操作条件温和，产出的丙酸绿色环保。所以发酵法生产丙酸在饲料和食品行业的竞争力是化学合成法难以达到的。微生物发酵法生产丙酸为丙酸合成提供了新的思路，同时得到了越来越多研究者的关注[13]。

当前丙酸发酵工艺已经在各个层次上展开，且各方面也都取得了一定的进展。但是由于发酵法生产丙酸产量低，终产物反馈抑制强，经济竞争力弱，还处于实验室研究阶段，离工业化生产还有一定的距离[14-15]。

1.1.4丙酸的提取方法

丙酸代谢产物为多种有机酸的混合物，丙酸的提取精制也是丙酸发酵工业化的一个难题[16-17]。迄今为止，应用于提取精制丙酸的方法如表1.2。

总结丙酸的提取方法有很多，如蒸馏法、离子交换法、电渗析法、溶剂萃取法、超滤膜法、结晶蒸馏法、盐析法等。单独使用这些方法，都存在难以避免的局限性[18]。如蒸馏法得到的往往是理化性质相近的丙酸、乙酸、琥珀酸等产物的混合体系应用萃取法时，反萃非常困难同时能耗较大超滤膜法成本过高，难以在工业化规模上应用[19]。

在以往的研究中，离子交换法在柠檬酸、乳酸等有机酸的提取中得到了较多应用，同时应用离子交换法易于实现络合发酵过程中丙酸的在线提取，因此，研究应用离子交换法提取丙酸发酵液混合体系中的丙酸，实现丙酸的藕合发酵，具有广阔的前景[20]。

表1.2 丙酸提取方法比较

Table1.2 Propionici acid extracting technology

名称	主要步骤	机理	优缺点	应用
离子交换	酸化、吸附、洗脱	吸附力不同	操作简单	有一定应用
结晶蒸馏	蒸馏 结晶	沸点相同熔点相差大	操作复杂	少
萃取和蒸馏	分配系数不同	分子量差异	效率低，产品质量差	生产丙酸盐
盐析	中和、酸化	酸碱反应	易操作	应用广泛
膜技术	过滤	各异	效率高成本高	少

国内关于丙酸提取的研究中，崔晓蓬[21]等采用离子交换层析技术提取发酵液中丙酸，同样张华峰[22]等采用离子交换法从发酵液中提取丙酸，对于丙酸发酵与维生素B12发酵而言，均具有较大的潜在应用价值。徐亲民[23]等将丙酸发酵的丙乙酸混合液酸化，并减压蒸馏来提取丙乙酸，同时回收氨、按盐及磷酸氢钙等副产品，工艺简单，回收率高。王金宇[24]等采用络合萃取法回收维生素B12发酵废液中的丙酸，通过确定络合萃取的最佳工艺条件，使系统运行的成本大大降低。但从总体来看，提取精制丙酸难度大，是丙酸生产费用最高的部分，提取精制方法还需进一步研究。

1.2微生物发酵法生产丙酸的研究进展

微生物发酵生产丙酸是一个古老的工艺，它起始于奶酪等奶制品的制作过程，在此过程中，丙酸菌主要起产酸和生香的作用[25]。以下将从丙酸的生产菌株及发酵工艺、丙酸菌的营养及环境、丙酸发酵模式、发酵液中丙酸含量检测等几个方面对发酵法生产丙酸的国内外研究现状进行总结。

1.2.1生产菌株

丙酸菌是一类以丙酸为主要代谢产物的革兰氏阳性菌，不产芽抱；厌氧至耐氧；菌体呈分枝或规则、不规则的杆状；化能异养；可代谢糖类、蛋白脏、丙酮酸及乳酸盐，产物为丙酸、醋酸和CO2等[26]。

目前国内外丙酸产量较高的菌株主要集中在特氏丙酸杆菌[27]（Propionibacteria thoenii）、费氏丙酸杆菌[28]（Propionibacteria freudenreichii）、谢氏丙酸杆菌[29]（Propionibacteria shermanii）和产酸丙酸杆菌[30]（Propionibacteria acidipropionici）等。其中产酸丙酸杆菌（Propionibacteria acidipropionici）被认为是发酵法生产丙酸最有前景的菌种。

针对产物丙酸和乙酸对菌体生长的抑制作用，Shang-Tian Yang[31]等人以产酸丙酸杆菌P9为出发菌株，利用基因操作技术，敲除了菌体中的乙酸激酶基因（ack）和磷酸转乙酞酶基因（pta），从而消除丙酸发酵过程中乙酸的形成，减少了乙酸对菌体生长的抑制。

1.2.2发酵工艺

研究人员发现不同菌株利用的碳源不同，产酸率也有所不同。Himmi[32]等人

比较了产丙酸丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌加发酵葡萄糖和甘油转化为丙酸的性能，得出结论产酸丙酸杆菌利用甘油转化丙酸的效率高，底物消耗快，丙酸产量高。Barbirato[33]等人也以甘油为底物，比较产酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)，P.acnes和Clostridium propionicum连续培养的实验结果，其中产酸丙酸杆菌将甘油转化为丙酸的效率和产量最高。

在发酵过程中，当丙酸达到一定浓度时，对菌体生长产生了抑制，仪宏[37]等研究了丙酸累积对薛氏丙酸杆菌生长及产酸的影响。作者证实，菌体和产酸量受丙酸抑制的程度与丙酸浓度成正比；他们发现，薛氏丙酸杆菌耐酸性强，当外加丙酸浓度达时，该菌株仍能缓慢生长产酸。

为了增加丙酸产量，Dong-Shik Kim[34]等向反应器中加入邻亚碘酰苯甲酸缓冲溶液，控制乙酸代谢流，消除乙酸对细胞的生长抑制，但是细胞生长和丙酸的产率都略有下降。这种方法降低了乙酸产量，但并没有从根本上消除乙酸的产生，而且造成了菌株生长速率的下降。

为了解除丙乙酸的抑制，许多研究人员设计了不同的反应器，采用了不同的发酵工艺，从而解除抑制，提高丙酸的产量。

V.Goswami[35]等人在发酵罐搅拌轴上安装一个孔式过滤器，以乳糖为底物利用酸式丙酸杆菌生产丙酸，含高浓度丙酸的发酵液进入过滤器内侧，细胞原位滞留，同时补加新鲜培养基继续培养，发现过滤器孔径大小是一个关键因素，10μm孔径的孔式过滤器细胞滞留率仅为31％，而5μm孔径的孔式过滤器细胞滞留率达到50％，丙酸产率达0.9g/(L h)，提高近4倍，且连续操作8天没有污染和堵塞问题。

任靓[36]等对游离、海藻酸钠包埋固定以及壳聚糖交联固定三种不同形式丙酸杆菌发酵的固定化颗粒性能、产丙酸量、pH值变化、残糖浓度变化等进行了对比研究。结果表明：使用壳聚糖交联固定的丙酸杆菌，分批发酵的产酸量可达14.6g/L，高于游离法(11.5g/L)和海藻酸钠包埋固定法(12.4g/L)；且在颗粒性能方法，比海藻酸钠固定颗粒有更强的耐酸性和更高的机械强度。

仪宏[37]等也利用薛氏丙酸杆菌在发酵维生素B12的同时联产丙酸钙，取得了重要成果，且该课题己经通过专家鉴定。

1.2.3代谢途径

产酸丙酸杆菌的发酵产物是丙酸、乙酸、琥珀酸和二氧化碳，如图1.2所示。葡萄糖进入细胞后经过糖酵解生成PEP，PEP是一种高能中间化合物，可以转化生成丙酮酸和草酰乙酸两种代谢物[38-39]。草酰乙酸通过琥珀酸生成途径进一步转化，最终生成琥珀酸。部分丙酮酸通过Wood-Werkman cycle途径生成丙酸，一小部分丙酮酸通过乙酸生成途径转化生成乙酸，一小部分作为碳源转化成菌体的组成部分。糖酵解包括EMP途径和HMP途径[41]，通过EMP途径每1mol葡萄糖转变为2mol的丙酮酸、2mol的NADH和ATP；通过HMP途径，每3mol的葡萄糖产生5mol的丙酮酸、5mol的ATP和11mol的NADH。通过对比EMP和HMP两种途径发现，每1mol的葡萄糖通过EMP和HMP途径代谢，分别生成2mol和5/3mol的ATP，2mol和11/3mol的NADH。EMP和HMP在细胞代谢中所占的比例取决于发酵所选用的丙酸菌种，发酵底物组成和发酵条件[40]。

在Wood-Werkman cycle途径中，丙酮酸在草酰乙酸转羧基酶的催化作用下生成草酰乙酸。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的作用下生成苹果酸，进一步在富马酸酶作用下生成富马酸；富马酸在琥珀酸脱氢酶作用下转化生成琥珀酸，琥珀酸进一步转化生成琥珀酸辅酶A和甲基丙二酰辅酶A。在草酰乙酸转羧基酶作用下，甲基丙二酰辅酶A转化生成丙酰辅酶A，最终丙酰辅酶A和琥珀酸在丙酰辅酶A：琥珀酸辅酶A转移酶的作用下，生成丙酸和琥珀酸辅酶A。在Wood-Werkman cycle中，1mol的丙酮酸生成1mol的丙酸，2mol的NAD+ 和1mol的ATP。在Wood-Werkman cycle中NAD+的再生是极其必要的，因为这是在丙酸菌细胞内唯一的一条NAD+的再生途径，这对消耗糖酵解途径中生成的NADH，从而维持菌体内NAD+与NADH的平衡是非常必要的。

在乙酸生成途径中，在丙酮酸脱氢酶复合体作用下，丙酮酸转化生成乙酰辅酶A和CO2，乙酰辅酶A具有高能硫酯键，很容易在磷酸转乙酰酶作用下生成乙酰磷酸。最终在乙酰激酶作用下生成乙酸。在乙酸途径中，1mol的丙酮酸生成1mol的乙酸、1mol CO2、1mol NADH和1mol ATP。可见，乙酸生成途径是一个产能的途径[41]。

一部分丙酮酸被菌体利用，作为菌体生物质的组成成分。细胞代谢中产生的NADH和ATP大部分被用来合成菌体成分。在前面提到，剩余的PEP随着代谢流合成草酰乙酸。在PEP羧化酶作用下，PEP和CO2合成为草酰乙酸。草酰乙酸转化生成苹果酸，之后，苹果酸转化为富马酸，富马酸最后生成琥珀酸。这些反应途径类似于琥珀酸的生成途径，是丙酸代谢途径的一部分。

综上，我们可以在理论水平得到一个等式[42]：

1.5mol glucose       2mol propionate + acetate + CO2 + H2O + 6 ATP

由反应方程式可以计算出以葡萄糖为底物生产丙酸的理论得率为54.8%，乙酸得率22%，CO2得率为17%，丙酸乙酸的比率为2:1。但是，在实际的发酵生产中，因为丙酸菌体的生长，丙酸菌发酵葡萄糖的得率往往小于50%。以往的研究中，丙酸得率通常保持在25%-40%之间[43]。

 

图1.2 丙酸杆菌的丙酸合成途径

Fig.1.2 The biological synthesis pathway of PA in P.acidipropionici

1.2.4发酵的营养及环境特性

(1) 丙酸杆菌营养特性研究

碳源作为丙酸杆菌正常生长的必需能量来源，直接影响丙酸的合成[44]。丙酸杆菌能够利用的碳源谱也较广，甘油、果糖、葡萄糖、麦芽糖、半纤维素、糖蜜、蔗糖、乳糖、木糖、乳酸等均可作为碳源被丙酸菌利用。在以上几种碳源的条件下进行发酵，得到的终产物成分基本相同，主要产物为丙酸，副产物有乙酸、琥珀酸和丙醇等，但是研究发现以葡萄糖、乳酸为碳源时产生的乙酸量比甘油高出50％[45]，同时甘油作为现代油脂工业的副产物也亟待被合理的利用，否则会对环境产生一定的压力。因此以甘油为碳源用于丙酸的发酵有很大的现实意义。Zhang[57]等以甘油为碳源时，得到的最高丙酸产量为106g/L。Coral[46]等发现以糖蜜为碳源会得到更高的菌体浓度。这可能是由于糖蜜中的营养成分较丰富，促进了丙酸菌的生长，同时糖蜜也是一种较廉价的营养源，在工业上的应用可以降低丙酸发酵的成本。

氮源的种类和氮源的浓度对丙酸杆菌的菌体生长和丙酸合成有着重要的影响。酵母粉、蛋白脉和玉米浆等均可以作为氮源被丙酸杆菌利用。乐华爱[47]等发现，北京丙酸杆菌(Propionibacterium beijingense)不能利用硫酸铵等无机氮源。此外，相对于酵母粉、酵母膏和蛋白陈等氮源，使用玉米浆为氮源时，得到菌体浓度较高，较廉价的成本也可以在工业化丙酸生产上广泛应用。

(2) 丙酸杆菌发酵条件的研究

pH值对丙酸杆菌生长与产酸均有显著影响。一般而言，菌体生长及产酸的最适pH值为6.5-7.5。国内学者徐虹[48]等设计了一种两阶段pH控制的策略用于丙酸发酵，前48h控制在获得菌体的最大比生长速率，48h后控制在获得菌体的最大比产物合成速率，该控制策略使丙酸产量提高31.8％。

温度对丙酸杆菌细胞的生长及产物的合成也有重要的影响，目前丙酸发酵多采用pH7.0、30℃的发酵条件。

1.2.5发酵模式的研究

丙酸发酵过程中有两个重要的问题制约产量的提高。首先培养体系中高浓度的丙酸对菌体的生长有巨大的产物抑制作用，并且影响代谢流的分布；其次高浓度的底物（乳酸、甘油、葡萄糖）对菌体的生长也有一定的底物抑制作用[49]。以下从流加发酵、萃取发酵、细胞固定化发酵、代谢工程菌发酵几个方面对近年来丙酸发酵模式的研究进展进行综述。

(1) 流加发酵

保持发酵体系中底物浓度在菌体能承受的范围内，能明显减弱对菌体的抑制作用，进而促进了丙酸的合成[50]。通过流加发酵对实现提高原料利用率、减少副产物、提高产量和提高生产强度有明显效果。同时，流加发酵的方式操作简单，适合工艺放大。

Goswami[51]等根据分批发酵的数据建立了数学模型，用于丙酸的补料分批发酵的研究，在两种流加速率下(0.3L/h和0.4L/h)，丙酸的生产强度分别提高34.7％和73.9％。

(2) 萃取发酵

萃取发酵由于随时将发酵过程中产生的丙酸与原发酵体系分离，使得发酵体系中的丙酸浓度一直维持在相对较低的水平，因此，能明显降低产物对菌体生产的抑制作用。

Jin和Yang[52]等将中空纤维膜反应器与萃取过程相结合起来通过补料进行连续发酵生产丙酸，生产强度达到1.2g/L h，是传统发酵的3倍，转化率由传统发酵的45％提高到58％，最终丙酸浓度达到75g/L。

萃取发酵也并不尽善尽美，目前来说，有以下三个方面的问题制约着萃取发酵的推广与应用：

合适萃取剂的选择较难。最优的萃取剂是除有很强的萃取能力外对微生物的生长还没有太大的影响，然而，目前所用的大部分萃取剂均为化学物质，或

多或少都会对菌体的生长产生一定的影响。‚萃取发酵时萃取效率对的依赖性较大。ƒ萃取发酵成本较高，难以推广于工业化生产规模之上。

(3) 固定化细胞发酵

自20世纪70年起就开始兴起固定化细胞技术，此种生物技术在几十年来的持续研究中得到了快速的发展，并被广泛的应用到各个领域中。固定化细胞的制备方法种类多样，基本上包括有：吸附法、交联法、包埋法及共价结合法[53-54]。

固定化发酵由于能将细胞固定于特殊的材料上，使得菌体对丙酸的耐性大大提高，易于实现丙酸杆菌的高密度发酵，产量及生产强度得到了一定提高。

赵树欣[55]等用海藻酸钠为固定化材料，固定化丙酸杆菌细胞，连续发酵22批次，65天可保持较好的发酵稳定性，此外对固定化丙酸杆菌和游离丙酸杆菌对不良环境的耐受力研究表明固定化丙酸杆菌能提高菌体的耐酸性，得到的最高丙酸产量是20g/L。

为了消除丙酸发酵过程中较强的产物抑制，提高丙酸发酵的生产强度，研究者研发了大量固定化细胞反应器用于丙酸发酵。徐虹[56]等设计了一种多点式纤维床反应器(multi point fibrous-bed bioreactor, MFB)用来进行丙酸的固定化发酵，发酵496h，得到的最高丙酸产量为67.05g/L。Zhang[57]等将丙酸细胞固定在FBB上，以甘油为碳源进行补料发酵，连续发酵近3个月，得到的最高丙酸产量为106g/L，这是资料报道的最高丙酸产量。但是较长的发酵时间、较低的发酵速率和较高的发酵成本却限制其在工业化规模上的应用；Coronad[58]等建立了固定化丙酸杆菌细胞在搅拌式发酵罐中发酵过程的动力学模型。

(4) 代谢工程手段的应用

代谢工程是生物工程的一个新的分支，通过基因操作实现代谢流的定向和定量控制，对微生物菌体代谢流进行特定的调控，从而实现目的产物产量的最大化。

乙酸作为丙酸发酵过程中产生的主要代谢产物，其生成不仅使得流向丙酸支路的代谢流减少，还对菌体有一定的抑制作用。Suwannakham[59]等对乙酸支路进行了基因操作，将乙酸合成中关键酶乙酸激酶的基因ACK进行了敲除，得到了一株代谢工程菌株ACK-Tet，相比于野生菌株，代谢工程菌株的丙酸产量上升了13％，乙酸产量下降了14％。Zhang[60]等将代谢工程菌株ACK-Tet固定于纤维床反应器FBB上，对菌种耐酸性进行了驯化，菌种耐酸性提高的同时，产酸量得到了提高，最高产量达到100g/L。

1.2.6发酵液中丙酸含量检测

检测丙酸的常用方法有滴定法、pH法等和气相色谱法等。前几种方法只能用于丙酸含量的粗测。发酵液中丙酸用气相色谱法检测，仪宏[61]等用毛细管气相色谱法，以萃取发酵液中丙酸，对发酵液中丙酸进行精确的测定。而杨金迪[62]等则是以三氯甲烷为萃取剂，用毛细管气相色谱法测定发酵废液中丙酸含量。但发酵液中同时积累丙酸和乙酸，而毛细管柱未能将丙酸、乙酸分离开并同时检测出。

1.3微生物发酵法生产丙酸存在的主要问题

虽然相对于化学法来说采用发酵法生产丙酸在环境保护与安全性方面具备的一定优势，是未来工业发展的方向，但是发酵法生产丙酸还存在以下一些问题，严重限制了在工业化规模上推广，主要包括[63-65]：

(1) 发酵终产物丙酸和乙酸对丙酸杆菌的生长及产物的合成有较强的反馈抑制作用，导致丙酸产量较低，同时丙酸杆菌属于厌氧菌，能量供应不足，生长缓慢，发酵周期较长致使丙酸发酵的生产强度较低难以在工业化上推广。

(2) 由于丙酸杆菌属于兼性厌氧菌，菌体生长缓慢，致使丙酸的发酵周期较长。

(3) 发酵终产物是由多种不同有机酸组合成的混合物，其中大部分是丙酸和乙酸这两种有机弱酸，这两种酸理化性质十分相似，要把丙酸从中分离，并进一步精制难度很大。

(4) 丙酸杆菌发酵产丙酸最适碳源为甘油，但是高浓度的甘油对细胞生长有较强的底物抑制作用，导致碳源的转化率和生产强度较低；同时工业上甘油的价格较为昂贵，运就提高了工业化规模生产丙酸的成本。只有通过不断改造菌种，优化生产工艺与生产模式，改进生产设备，才能改变发酵法生产丙酸模式，成为丙酸生产的主流方法。