前 言
鼻息肉是耳鼻喉科临床上常见的疾病，具有较高的发病率和复发率，其病因和发病机制目前仍不能明确，且临床表现具有显著的异质性，使得治疗措施及疗效也不尽相同。既往对鼻息肉的研究着重于变态反应的因素，随着对鼻息肉的研究发现长期的炎症刺激、鼻腔的解剖异常、中鼻道的微环境改变等共同影响着鼻息肉，而现在普遍认为炎症的刺激是导致鼻息肉病变的重要原因之一[2],慢性炎症的刺激往往由炎性细胞及分泌的细胞因子引发的，根据鼻息肉病理组织中的炎性细胞浸润类型, 有些学者开始将鼻息肉具体分为以嗜酸性粒细胞浸润为主和非嗜酸性粒细胞浸润为主的两大亚型[3]。
随着国内外的学者们对鼻息肉的不断深入研究，发现西方和亚洲地区的鼻息肉病理特点有所不同，西方的以嗜酸性粒细胞的浸润为主，免疫细胞以TH2细胞为特征，而亚洲是以中性粒细胞型的浸润占主导，主要集中于TH1/TH17细胞的免疫反应，且西方人合并哮喘的高达20.0%～31.9%，亚洲的却只有2%～3%[4]。在中性粒细胞的浸润为主的鼻息肉患者中，其鼻腔分泌物的中性粒细胞浸润含量显著高于以嗜酸性粒细胞的浸润为主的鼻息肉患者。这表明中性粒细胞浸润在鼻息肉发生中起到重要作用[5]。Cao等研究显示我国中部地区约50%左右患者的鼻息肉呈现出嗜酸性粒细胞性为主，且嗜酸性粒细胞型鼻息肉中的Th1细胞 /Th17细胞的反应明显较中性粒细胞型鼻息肉的增强[6]。董震等在研究东北地域的鼻息肉中也发现只有43%是以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润[7]。既往研究发现，嗜酸粒细胞能够通过释放体内的蛋白酶导致组织的水肿，而且组织的水肿程度和嗜酸粒细胞的阳离子蛋白含量呈正相关，而间质纤维化与中性粒细胞的浸润程度呈正相关；嗜酸粒细胞型鼻息肉组织的水肿程度显著强于非嗜酸性粒细胞型鼻息肉，其纤维化程度明显低于中性粒细胞型[8]。因此，虽然中性粒细胞和嗜酸粒细胞的浸润均能导致息肉的发生，但中性粒细胞和嗜酸粒细胞的相对平衡使得这两种的炎症状态下使得鼻息肉组织表现出不同的重塑特点。
鉴于不同类型的炎性细胞型鼻息肉呈现出不同的治疗效果，某种程度上反映出其发病机制的不同，鼻息肉的炎性细胞亚型的病理学机理的研究成为近几年研究的热点。在鼻息肉的基因芯片研究中发现中性粒细胞的趋化因子IL-8 的表达水平在非嗜酸性粒细胞型鼻息肉中有所明显得增高，这表明中性粒细胞在非嗜酸性粒细胞型息肉中占有重要位置。Besancon-Watelet等[9] 发现中性粒细胞浸润为主的鼻息肉患者，其鼻腔分泌物中IL-8 的含量明显高于嗜酸性细胞浸润为主的鼻息肉患者, 说明IL-8在中性粒细胞型鼻息肉中发挥着重要作用，而IL-17可以通过介导IL-8和GRO-a来刺激鼻腔的黏膜，促进组织的成纤维细胞的形成，提示鼻息肉在发病过程中可通过IL-17的释放来加强中性粒细胞的趋化并发挥到组织重塑的功能，反之，中性粒细胞能够通过诱导Th17细胞分泌IL-17,而IL-8也可由中性粒细胞分泌，从而这种互相作用加剧了鼻息肉的形成[10]。
嗜酸性粒细胞型鼻息肉与非嗜酸性粒细胞型鼻息肉相比，前者对糖皮质激素更加敏感，而后者却表现出疗效较差[11]。大环内酯类药物对治疗难治性鼻窦炎、糖皮质激素耐药的鼻息肉却有着良好的疗效，这与其作用于中性粒细胞密不可分的；经临床研究证实长期口服大环内酯类的抗生素能明显改善鼻息肉，如减少鼻腔分泌物，改善黏液的传输速率，以及鼻内镜下检查鼻息肉的病变程度缩小，CT 影像学检查鼻窦的炎症减轻等，研究发现在鼻息肉的治疗中此抗生素作用的机理是通过抗炎而非抗菌，加速诱导中性粒细胞凋亡，抑制其脱颗粒，并阻碍细胞因子和炎性介质的表达及释放[12]。
鼻内镜、鼻窦CT的客观性评估，以及视觉模拟量表（visual analogue scale，VAS）主观症状的评估已为作为临床上常用的评估患者症状轻重、治疗措施及治疗效果的反馈。在一定程度上能反映其不同类型的鼻息肉临床特点。
因此，以上研究的成果为本研究提供了基础及依据，不同的炎性细胞类型在鼻息肉中发挥的作用不同，为其发病机制的探索起到了一定的作用，因此，通过临床特征和免疫组化检查IL-17、IL-8在鼻息肉组织中的表达，提示中性粒细胞型鼻息肉的特点，为今后临床上鼻息肉疾病的预防、治疗的指导提供新的策略。
1.1样本的选择
收集2016年3月至2016年9月在我科行鼻内镜下手术的患者鼻息肉组织,经HE染色观察后随机选取以中性粒细胞为主型的鼻息肉30例，并收集的对应临床资料；随机选取嗜酸性粒细胞为主型的鼻息肉30例，及收集的对应临床资料；选取鼻中隔偏曲行矫正术的患者部分下鼻甲粘膜20例。所有患者均行血清过敏原检测以排除合并过敏性的疾病方可纳入选择的对象。并且所有的临床资料及实验组织都经患者的同意并签署知情同意书。
入选排除的条件：1.有哮喘史及全身严重疾病史，术前1月未使用抗生素、抗组铵等药物治疗，感冒（特别是发热）及口服感冒药的患者。2.口服或静脉使用糖皮质激素（如地塞米松）30天以上。3影响IgE的其他疾病，过敏性皮肤病如湿疹、荨麻疹、特应性皮炎等；4有.囊性纤维化、真菌性鼻窦炎、不动纤毛综合征；5.合并自身免疫性疾病（系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等）或免疫缺陷病；6.正在进行脱敏治疗的患者；7.伴有阿司匹林不耐受三联征（变应原阴性，嗜酸性粒细胞数增多）8.IgE阴性，临床出现鼻塞、鼻痒、清水样流涕、打喷嚏，如血管运动性鼻炎（变应原阴性、嗜酸性粒细胞数正常；9.体内寄生虫感染、传染性疾病、肿瘤等。
1.2 临床收集的方法
对入选的鼻息肉患者进行术前病史采集，视觉模拟量表（visual analogue scale，VAS）的评估，CT检查并经Lund-Mackay评分，鼻内镜下的观察。
1.2.1鼻窦CT检查方法
冠状位的扫描由鼻骨到蝶窦的后壁，基线为垂直于前额的底部，轴位的扫描以听线为扫描基线，由额窦到硬腭的连续扫描，需2mm层厚和5mm间距。
鼻窦CT评分方式：按Lund-Mackay的评分[13]，以鼻窦和鼻道窦口复合体（OMC）为要点，分别计算每侧情况。鼻道窦口复合体（OMC）的阻塞程度：0分=无阻塞；2分=阻塞。鼻窦的浑浊情况：将鼻腔鼻窦的形态各分为左右两侧，每侧划分为上颌窦，前组、后组筛窦，额窦和蝶窦5个部位，每个鼻窦以0分=无异常；1分=部分的浑油；2分=完全的浑独。每侧的鼻道窦口复合体和鼻窦的总分即为一侧的评分分数，每侧最低为0分，最高为12分，轻度＞0-10 分；中度＞11-20 分；重度＞21-24 分。
1.2.2 鼻息肉的评分
按Lund-Kennedy[14]的评分法，分别对每侧的鼻息肉作评分，无息肉的为0分，未超出中鼻道的为1分，超出中鼻道未到达下鼻甲的为2分， 充满总鼻道的为3分。
1.2.3 主观病情的评估
通过视觉模拟量表(visual analogue scale,VAS)[15]进行评分，症状主要包括：鼻塞，流粘脓性涕，面部胀闷，嗅觉减退。各个鼻部症状的评分之和即为患者的VAS评分，轻度为0-3分，中度大于3-7分，重度大于7-10，VAS在5分以上者，提示其生活质量受到影响。在一个10cm的标尺上从左端至右端以此标记0-10分。最严重为10分，无症状为0分，从左向右分数越高，其症状的严重程度呈逐渐性加重。
在鼻内镜手术过程中用钳夹出鼻息肉患者的部分鼻息肉的组织为标本，对鼻中隔偏曲的患者在手术时夹取下鼻甲的正常部分黏膜组织，把掺杂其他的组织清除，然后用生理盐水进行冲净，再将其置入中性福尔马林溶液浸泡24至48小时，以至于脱掉组织内的水份，最后对其包埋制造成石蜡包块。
1.4 实验的主要试剂和溶液配置
（1）苏木精、伊红染色：购买于博士德（武汉）生物有限公司
（2）兔抗人IL-17多克隆抗体：购买于博士德（武汉）生物有限公司
（3）兔抗人IL-8多克隆抗体：购买于博士德（武汉）生物有限公司
（4）抗体专用稀释液：购买于博奥森（北京）生物技术有限公司
（5）免疫组化试剂盒（SP-0023）：购买于博奥森（北京）生物技术有限公司
（6）免疫组化的DAB显色试剂盒：购买于博奥森（北京）生物技术有限公司
（7）0.01M枸橼酸钾缓冲液、0.01M磷酸盐缓冲液PBS：购于北京的中杉金桥生物技术有限
1.5 载玻片的处理
将载玻片放入配置的强酸溶液中24h小时,在无菌的净水中冲洗掉残留的液体，其次放入烤温箱中进行烘干,然后放入防脱片溶液中浸20分钟，随后放于常温环境中蒸发防脱溶液吗，或再放入烤温箱中进行烘干，最后把制作好的载玻片在常温下保存。
1.6 实验中的仪器和设备
石蜡切片机 中仪光科（北京）科技发展有限公司
高压锅 九阳（天津）股份有限公司
恒温烤箱 中威（常州）电子仪器有限公司
4℃冰箱 西门子公司（德国）
医学生物数码显微镜 德罗姆科学仪器（日本）有限公司
移液器（20ul、200ul、1000ul） 热电（上海）仪器有限公司
图像收集分析软件 明特（成都）科技有限公司
2.实验方法与步骤
2.1标本的制备和处理
(1)脱水、透明：标本置入不同浓度的酒精中，完全脱水后，取出组织放入配置好的二甲苯中进行透明三次，每次各15分钟。
(2)浸蜡、包埋：将透明后的组织放入已融化的液态石蜡中进行浸蜡，然后放入固定的石蜡容器框中进行冷却，石蜡凝固成包块后，即完成了包埋。
(3)切片、烤片：将制好的石蜡包块进行冷藏，约15min，用切片机将其连续切成5μm的切片，将切好的标本于48℃的恒温水浴中铺平，然后使切片平展置入载玻片中，并做标记，最后放入恒温烤箱中24小时即可。
(4)脱蜡:将切片预热15分钟后放入三个不同浓度的二甲苯溶液中（每个5分钟）。然后依次放入四个不同浓度的酒精中（每个2分钟），随后把载玻片置于3%的双氧水中（常温15分钟），再放入蒸馏水中浸泡（约2分钟），取出后用PBS溶液中浸泡3次（每次2分钟）。
2.2 苏木精、伊红染色
切片经苏木精染色5分钟后蒸馏水冲洗，再由伊红染色2分钟，再次进行脱水透明和封片，在显微镜下随机选择标本的10个高倍镜视野观察并记录组织中的中性粒细胞数。
2.3 免疫组化染色IL-17、IL-8
（1）抗原修复：高压锅中放入柠檬酸盐缓冲液，煮沸后放入脱蜡水化的切片,加温到有白雾后再调温至140度进行煮沸2分钟，恢复到常温的状态。将玻片放入PBS溶液中进行3次的冲洗（每次2分钟）。
（2）滴加一抗、二抗：在玻片标本上滴入IL-17兔抗人多克隆抗体，另一个玻片标本中滴入IL-8兔抗人多克隆抗体，放置于37度恒温箱中进行2小时的孵育，然后经PBS溶液冲洗，2分钟*3次。清除标本周围的残留PBS液，加入山羊抗兔Ig G二抗后于38℃的恒温箱中孵育20分钟，再经PBS缓冲液冲洗，2分钟*3次。
(3)DAB显色：在避光条件下滴加显色液。并置于显微镜下观察，玻片上的组织开始呈现棕黄色时，立即终止染色。
（4）苏木素复染：玻片放入苏木素中染色30秒，在蒸馏水中进行冲洗，再放入盐酸酒精中10秒，取出后再次冲洗，然后在氨水中进行返蓝15秒。
（5）脱水、透明：将玻片标本依次放入70%的乙醇*5分钟、90%的乙醇*20分钟、无水酒精*5分钟、二甲苯*10分钟（3次）中，进行脱水、透明，结束后置于通风区域晾干。
（6）封片后观察：,用树胶滴固定标本后压盖载玻片，通过显微镜下进行观察IL-17和IL-8的表达。
2.4 实验结果判定标准
采用Wenzel SE等[1]以炎性细胞的百分比例＞正常对照组的均数+2倍的标准差为分类，本实验中性粒细胞数目为1.25%±1.37%，因此中性粒细胞＞4%(1.25+1.37×2=3.96)归为中性粒细胞型鼻息肉；嗜酸性粒细胞大于8%（4.4%+2×1.7%=7.9%）定义为嗜酸性粒细胞型鼻息肉。
IL-8、IL-17阳性染色为黄色或棕黄色颗粒，400倍显微镜下，随机选择标本的10个高倍镜视野，再经数据处理器处理，分别计算出中性粒细胞、嗜酸性粒细胞额阳性细胞所占总的比率。依据阳性细胞所占比值分为4个级别[16]：1分=阳性比例≤10%，2分=阳性比值10%--25%，3分=阳性比例26%--50%，4分=阳性比例≥50%。再根据标本染色的程度:1分=无黄色，2分=浅黄色；3分=棕黄色；4分=褐色。将以上两种的计分进行相加，其结果为判断标准:0-2分=阴性（-），3-5分=弱阳性(+)；6-7=强阳性(++)。
3.统计学处理
使用SPSS19.0 软件对实验结果进行统计数据并处理分析。用卡方（
检验）对实验组与对照组中的阳性率进行比较，
提示有统计学意义，余用
,进行t检验，Mann-Whitney Test（Z）进行分析，
，其差异有统计学意义。
（1）NEUP的性别、身高、体重及外周血中性粒细胞百分比与ENP无明显的不同（
），提示这方面NEUNP与NP无显著不同。
NEUNP 和ENP两组患者的外周血嗜酸性粒细胞的百分比(%)，分别为3.42±1.86和6.52±3.31，
，其差别有统计学意义；NEUNP 和ENP两组患者的外周血嗜酸性粒细胞细胞百分比大于正常范围水平的所占比例分别为33.3%（9/27）和6.1%（2/33），
，其差别有统计学意义（表1）。
表1 NEUNP和ENP患者的一般资料的对比
|
组别 |
NEUNP |
ENP |
|
年龄 |
46.95 |
40.29 |
|
男/女 |
20/7 |
24/9 |
|
血嗜酸性细胞百分比(%) |
6.52 |
3.42 |
|
血中性粒细胞百分比（%） |
53.76 |
54.63 |
（2）NEUNP、ENP组患者鼻息肉病变程度分别为3.05
1.32，2.98
1.45，
，
无明显差异。
表2 NEUNP和ENP患者的鼻内镜下对比
|
鼻息肉 |
NEUNP |
ENP |
|
病变得分 |
3.05 |
2.98 |
（3）NEUNP组患者的流脓涕程度（6.35±1.20）明显高于ENP组（5.69±1.31），
，其差别有统计学意义；NEUNP组患者的嗅觉减退程度（3.83±1.68）明显低于ENP组（5.54±2.31），
，其差别有统计学意义（表3）
|
组别 |
NEUNP |
ENP |
|
鼻塞 |
6.68 |
6.86 |
|
流粘脓涕 |
6.35 |
5.69 |
|
嗅觉减退 |
3.83±1.68 |
5.54±2.31 |
|
面部憋胀感 |
3.97 |
3.36 |
|
头晕或头痛 |
3.89 |
3.83 |
|
症状之和 |
18.73 |
17.32 |
（4）NEUNP组患者的上颌窦的病变程度（3.14±1.21）明显高于ENP组（2.05±1.02），
，其差别有统计学意义；NEUNP组患者的前组筛窦的病变程度（2.95±1.13）明显低于ENP组（3.48±0.53），
，其差别有统计学意义；NEUNP组患者的后组筛窦的病变程度（1.54±0.93）明显低于ENP组（3.07±1.05），
，其差别有统计学意义。
NEUNP组患者的前组筛窦的病变程度（2.95±1.13）明显高于其后组（1.54±0.93），
，其差别有统计学意义。
NEUNP患者的鼻窦病变程度整体情况（9.59±3.35）明显低于ENP（14.43±3.81），
，其差别有统计学意义；ENP其前、后组筛窦的病变程度较接近，分别为3.48±0.53和3.07±1.05），
，无统计学意义。（以上见表4）
上颌窦、筛窦的病变明显强于其他的情况，在讨论中也要提到
表4 NEUNP和ENP患者的CT对比
|
组别 |
NEUNP |
ENP |
|
上颌窦 |
3.14 |
2.05 |
|
前组筛窦 |
2.95 |
3.48 |
|
后组筛窦 |
1.54 |
3.07 |
|
蝶窦 |
2.15 |
2.27 |
|
额窦 |
2.58 |
2.45 |
|
OMC区 |
3.26 |
3.63 |
|
症状之和 |
9.59±3.35 |
14.43 |
与对照组相比，鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞、浆细胞及巨噬细胞（CD68）明显增多。42例鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞大于8%者占42.9%（18/42）。
12.32
13.36
3.31
1.86
7.49
8.35
1.32
1.45
1.06
1.35
1.20
1.31
1.65
1.96
1.84
1.87
4.32
4.26
1.21
1.02
1.13
0.53
0.93
1.05
0.87
1.43
1.23
0.92
1.17
0.97
3.81