1 前言

癌症使人类的生存和社会的进步遭到威胁，用科学的方法对癌症进行预防控制也已经迫在眉睫。

人血清白蛋白和芳基钌配合物相互作用的探索有助于抗癌事业的进行。

1.1 人血清白蛋白的研究进展及应用

蛋白质对生命体十分重要，其相对分子质量很大，其结构由二十多种氨基酸构成，含有多种金属元素和非金属元素，各项生命活动和因外界环境所引起的刺激都需要蛋白质的支撑。全部的生命体内都有蛋白质的存在，全部生命体的构成都需要蛋白质的参加，全部细胞的构成也必须要蛋白质的参加[1]。生命体所需的各种能量、调节各项生理功能、传递、运输、信号传导、载体和各种的构架材料等都需要蛋白质来完成。

蛋白质分子的构造有四个级别，这四个级别都是由肽链构成的。每个级别都有各自的特点，在某些级别中含有R基、羟基和氢基等，由于各种基团间的相互作用相互影响而产生了多种非常重要的作用力。一级结构是由氨基酸通过共价键结合而成的，是所有结构中最基本、最稳定的结构。除一级结构外，其他三种级别的结构都形成蛋白质的空间结构，由肽链组成的这些级别的结构可以形成多种各具特点、丰富多样、形状各异的构象[2]。

HSA是血浆中不可多得、十分宝贵的蛋白质[3]，是体内转运药物不可缺少的蛋白质，也是最好的转运蛋白质，可以转运多种非常重要的分子。与其他蛋白质相比，人血清白蛋白具有其他蛋白质没有的优点，其最大的优点就是能够很好的与各别药物作用、简单、易得。选择人血清白蛋白是因为人血清白蛋白与药物的特殊关系，能让药物很快且准确到达需要到达的部位。可以以人清血白蛋白的变化得到的数据为依据诊断疾病，所以人清血白蛋白是检验健康和疾病最好的蛋白。

人血清白蛋白是由SiteⅠ、SiteⅡ和SiteⅢ三个结构域构成，其中各个结构域又分别由两个亚结构域A与B构成[4]。

人血清白蛋白可以与不同物质结合产生不同的药理作用，人血清白蛋白有抗凝作用、可以维持血液酸碱平衡，对生物体来说是一种非常重要的物质，因此人清血白蛋白可以用于治疗多种疾病和症状，对于生命体具有重要的意义，可以改善很多难题。对人血清白蛋白应用的研究还在不断的发展。

1.2 芳基钌配合物的研究进展

药物是在生命体遭到伤害时作为一种生命的救治和延续，可以使生物体得到暂时的预防和保护，但并不是万能的。为了让生物体得到更多的保护、预防，为世界做出贡献，对于药物的研究，药物与人血清血白蛋白的作用，产生的影响直接能影响到生命体。目前，癌症是世界上的一大难题，所以要不断研究抗癌药物[5]。芳基钌这一类药物对于抗癌具有十分大的前景[6]。

芳基钌配合物是一类具有特点，最具前景，发展很好的物质。其有非常特殊的结构和可以形成丰富多样、形状各异的模式，其特点是至少含1个M-C键(M为金属中心,C为碳)， 有多种成键模式，所以有利于抗癌药物的研制。芳基钌配合物结构(见图1)，Cl离子的作用是能使芳基钌配合物更加易于溶解，并且有助于某些物质的水解。芳基配体Cym可以使芳基钌配合物更加稳定，更易于与水的结合，而且能很快的转运物质[7]。

(图1)

芳基钌配合物是一类具有特点，最具前景，发展很好的物质，芳基钌配合物能够很好掌控某些配合物金属的一些特殊性能，所以对生命体有至关重要的作用。对芳基钌配合物的研究，有待进一步的开发和研制有潜在价值的药物[8]。

本实验主要运用光谱法探索芳基钌抗肿瘤药物与HSA的作用机制。

2 实验部分

2.1 试剂和仪器

HSA和PBS是从美国密苏里州的圣路易斯Sigma公司购置的，HSA的储备溶液的制备方法是用其粉末溶解在pH=7.4的PBS中。华法林和布洛芬试剂也是从美国密苏里州的圣路易斯Sigma公司购置的，华法林和布洛芬溶液的配制主要是通过精准称量其固体溶于超纯水中。其他试剂为分析级试剂，不需要进一步纯化，可以直接使用。通过紫外可见吸收光谱可测得HSA的使用浓度。

LS-55荧光分光光度计(Perkin Elmer公司)；RF-5301PC荧光分光光度计(岛津公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(中国)；Chirascan圆二色光谱仪(英国Applied Photophysics公司)；KQ2200型超声波清洗器(超声仪器有限公司)；Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司)。

2.2 实验方法

2.2.1 荧光光谱

开好仪器，控制恒温槽的温度为实验条件所需要的温度，选择合适的狭缝范围，以295纳米为激发波长，扫描的波长范围在300到450纳米之间。本实验过程中，HSA的浓度保持不变，加入芳基钌配合物，即可开始扫描。

2.2.2 紫外可见光吸收光谱

在实验过程中，扫描的波长范围在190到600纳米之间，人血清白蛋白的浓度保持不变，加入芳基钌配合物，即可开始扫描。

2.2.3 离子竞争实验

在实验过程中，选择合适的狭缝范围，扫描的波长范围在300到500纳米之间，以295纳米为激发波长，人血清白蛋白的浓度保持不变，向芳基钌配合物和HSA体系中加入金属离子，即可开始扫描。

2.2.4 三维荧光

在实验过程中，使用的参比溶液是PBS，选择合适的狭缝范围，扫描的波长范围在200到500纳米之间，HSA的浓度保持不变，加入芳基钌配合物，即可开始扫描。

2.2.5 圆二色谱

圆二色谱的测量所用的仪器是Chirascan圆二色光谱仪英国(Applied Photophysics公司)。在实验过程中，持续充氮气以保持整个实验的稳定进行，人血清白蛋白的浓度保持不变，有规律的增加芳基钌配合物的浓度，即可开始扫描。

3 结果与讨论

3.1 探究芳基钌配合物对HSA荧光光谱的影响及荧光猝灭的机理。

3.1.1 芳基钌配合物对HSA荧光光谱的影响

HSA的荧光主要来源是色氨酸残基[9]。人血清白蛋白的微环境非常灵敏，为了能顺利探究芳基钌配合物与人血清白蛋白的荧光光谱，就要排除芳基钌配合物对实验的影响。可以利用荧光光谱来检测HSA和芳基钌配合物的荧光来判断是否产生影响。利用HSA分子的内源荧光，以295纳米为激发波长，发现350纳米周围有十分强的峰，当用相同的条件激发芳基钌配合物溶液时，在350纳米附近则没有出现峰。说明芳基钌配合物不会与HSA相互干扰。

在实验过程中，HSA的浓度保持不变，有规律的加入芳基钌配合物。

图2中，芳基钌配合物的添加，浓度也随之增加，HSA的光谱强度不断下降，但是光谱的发射位置和形状基本保持不变，这表明芳基钌配合物与HSA的作用，使HSA的微环境发生了变化，而且从图中知道HSA出现了规律的猝灭现象。

图2 芳基钌配合物对人血清白蛋白荧光光谱的影响

3.1.2 荧光猝灭机理

猝灭过程有动态猝灭和静态猝灭这两个阶段，温度可以对猝灭阶段产生影响，可以根据猝灭过程对温度产生的改变来区分为何种猝灭类型，若猝灭常数跟着温度的升高而上升，就可以判断为动态猝灭；若猝灭常数跟着温度的上升而降低，就可以判断为静态猝灭[10]。

为了知道芳基钌配合物与HSA为何种猝灭类型，则探究芳基钌配合物与HSA的猝灭机理，实验分别在三个温度下(T=298K，T=304K和T=310K)测定体系的猝灭常数。无论是静态还是动态猝灭，都遵循Stern-Volmer方程[11]：

                                        

公式(1)中F-存在猝灭剂时人血清白蛋白的荧光强度；F0-不存在猝灭剂时人血清白蛋白的荧光强度；[Q]-猝灭剂的浓度；Ksv-Stern-Volmer方程的猝灭常数。

Ksv的值可由公式(1)中用(F0-F)/F对[Q]作图(图3)求出。

温度会使猝灭受到影响，温度上升，猝灭常数跟着温度的上升而上升，就可以判断为动态猝灭；若猝灭常数跟着温度的上升而降低，就可以判断为静态猝灭。从图3可以看出，随温度的上升，直线的斜率呈下降趋势。计算出三个温度下的猝灭常数，结果列于表1，从表1可以看出，随着温度的上升，猝灭常数也呈降低趋势。则说明芳基钌配合物对HSA的猝灭机理是静态猝灭。

图3 三个温度下芳基钌配合物对HSA作用的Stern-Volmer关系图

表1 三个温度下芳基钌配合物与HSA作用的Stern-Volmer猝灭常数

Drug	T/(K)	Ksv (105L·mol-1)	Ra	S.D.b
pH=7.4	298	5.08	0.998	0.00258
	304	4.27	0.999	0.00454
	310	3.71	0.998	0.00762

3.2 芳基钌配合物与HSA相互作用的结合常数

为了得到芳基钌配合物与人血清白蛋白的结合常数，已知芳基钌配合物对HSA的猝灭机理是静态猝灭。有关静态猝灭的猝灭数据可以用修正Stern-Volmer方程[12]来处理，能获得结合常数K。

公式(2)中ΔF-增加猝灭剂前后人血清白蛋白的荧光强度变化。F-存在猝灭剂时人血清白蛋白的荧光强度。F0-没有猝灭剂时人血清白蛋白的荧光强度。[Q]-猝灭剂浓度。fa-溶剂的荧光摩尔分数。Ka-有效猝灭常数且可用作结合常数。

K的值可由公式(2)中用ΔF/F对1/[Q]作图(图4)求出。

在实验过程中，在不同的温度下(298K、304K和310K)，HSA的浓度保持不变，有规律的加入芳基钌配合物，根据公式(2)来拟合计算结合常数。

从图4中得知，随着温度的上升，直线的斜率呈降低趋势，猝灭常数也呈降低趋势。由此也可说明芳基钌配合物对HSA的猝灭机理是静态猝灭。

图4 三个温度下芳基钌配合物与HSA的修正Stern-Volmer关系图

静态猝灭会对荧光团的吸收光谱有影响，而静态猝灭对荧光团的吸收光谱无影响。为了能更具体、准确的确定芳基钌配合物与HSA的猝灭机理，可以通过紫外可见吸收光谱来判定体系是静态猝灭还是动态猝灭。

从图5中可以看出，[HSA-芳基钌配合物]-芳基钌配合物与只有HSA存在情况下的紫外吸收光谱不能很好的重叠。又一次说明了芳基钌配合物与HSA猝灭机理是静态猝灭。

图5 芳基钌配合物与HSA作用的紫外光谱