3.3 芳基钌配合物与HSA相互作用的结合模式

通过热力学参数，可以得知药物与HSA间的关系。药物与蛋白质之间的相互作用力关系有很多种(氢键、静电作用力、疏水作用力及范德华力等)[13]。在反应中，当焓变没有明显变化时，则把反应焓变视为常数，可以根据van't Hoff方程计算出反应的焓变(ΔH)和熵变(ΔS)。

公式（3）中Ka-对应温度下的结合常数，R-摩尔气体常数。用lnK对1/T作图得图6，由截距可以得出焓变ΔH，由斜率可以得出熵变ΔS。公式(4)中ΔG-吉布斯自由能。ΔG的值可根据公式(4)求得。                                                        

很多实验结果总结出药物与HSA间的相互作用力关系：ΔS<0可能是范德华力和氢键；ΔS<0，ΔH<0是范德华力和氢键；ΔS>0可能是静电和疏水作用力；ΔH较小或约为零，ΔS>0是静电作用力；ΔH<0时主要作用力是静电作用力；ΔS>0，ΔH>0是典型的疏水作用力[14]。

从图6中可以看出，芳基钌配合物与人血清白蛋白的关系图，表现出很好的线性关系，则把焓变视为常数对待。从表2中，ΔG<0，则说明芳基钌配合物与HSA结合是自发过程。从表中还可以看出芳基钌配合物与HSA作用中力ΔS<0，ΔH<0。说明了芳基钌配合物与HSA间是范德华力和氢键作为主要作用力。

图6 芳基钌配合物与HSA作用的van't Hoff关系图

表2 三个温度下芳基钌配合物与HSA作用的热力学参数

System	T (K)	Ka (105L·mol-1)	ΔH (kJ·mol-1)	ΔG (kJ·mol-1)	ΔS (J·mol-1·K-1)	Ra	S.D.b
Drug-HSA	298	3.47	-77.35	-31.98	-152.25	0.999	0.0611
	304	2.27		-31.07		0.999	0. 117
	310	1.18		-30.15		0.999	0.215

3.4 芳基钌配合物与HSA作用的结合位点

HSA是由SiteⅠ，SiteⅡ和SiteⅢ三个结构域组成，其中每个结构域又分别由两个亚结构域(Subdomain)A与B组成。形成圆筒状结构相对的方式。亚结构域ⅡA(Sudlow's SiteⅠ)和ⅢA(Sudlow's SiteⅡ)的疏水腔是HSA的主要键合区域，这两个亚结构域有着相似的化学性质[15]。

为了获得芳基钌配合物在人血清白蛋白的结合位点，Warfarin和Ibuprofen是常用的位点标记物[16]，实验使用华法林(Warfarin)作为SiteⅠ位和布洛芬(Ibuprofen)作为SiteⅡ位，作为标记物找出芳基钌配合物在HSA上的结合位点。

在实验的过程中，HSA的浓度保持不变，分别加入华法林与布洛芬位点标记物，以295nm为激发波长，有规律的加入芳基钌配合物。

从图7中可以看出，加入布洛芬和华法林后荧光光谱的强度都降低了，继续加入芳基钌配合物，荧光光谱的强度都持续降低。当加入布洛芬时，HSA的荧光峰值没有明显的变化，而当加入华法林时，HSA的荧光峰值有比较明显的变化。

为了能更准确的得知芳基钌配合物与人血清白蛋白的结合位点，实验根据修正的Stern-Volmer方程(2)对实验数据进行处理得图8，根据图8计算得到的结合常数，结果见表3，可以明显的看出华法林的变化幅度较大，所以可以得出结论是华法林与芳基钌配合物竞争同一个位点，即SiteⅠ位。

图7 位点标记物对芳基钌配合物-HSA体系的影响

图8 芳基钌配合物-HSA体系位点竞争实验结果图

表3 芳基钌配合物-HSA体系位点竞争实验键合常数比较

Drug–HSA system	T (298K)	Ksv (105L·mol-1)	Ra	S.D.b	Ka (105 L·mol-1)	Ra	S.D.b
	Blank	5.08	0.998	0.013	3.47	0.999	0.285
	Ibuprofen	5.21	0.999	0.011	3.82	0.999	0.181
	Warfarin	7.40	0.996	0.030	2.61	0.999	0.091

3.5 共存离子对芳基钌配合物-HSA体系的影响常

有些离子能与HSA作用，占据药物与HSA作用的位点，影响药物与人清血白蛋白的作用，离子对体系的作用的不同就会使药物与HSA的作用受到不同的影响，研究离子对药物-HSA体系的影响，对于开发新药和治疗疾病具有重要的意义[17]。本实验探讨共存离子对芳基钌配合物-HSA体系的影响，主要探讨Ca2+、Cu2+和Mg2+离子对芳基钌配合物-HSA体系的影响。

在实验过程中，HSA的浓度保持不变，在其中分别加入浓度固定的离子(Ca2+、Cu2+和Mg2+)，以295纳米为激发波长，有规律的加入芳基钌配合物。

从图9 中可以看出，这三种金属离子(Ca2+、Cu2+和Mg2+)的加入使芳基钌配合物-HSA体系的键合常数值均有不同程度的减小。

为了能更好的得知这三种金属离子对芳基钌配合物-HSA体系的键合常数的影响程度，根据Stern-Volmer方程(2)对数据处理得到图10，数据显示于表4中，明显的知道，三种金属离子都使芳基钌配合物-HSA体系的键合常数下降了。当加入金属离子后，芳基钌配合物-HSA体系键合常数降低，这可能是由于加入金属离子后，抑制了芳基钌配合物与HSA的相互作用，从而导致键合常数降低。

图9 共存离子对芳基钌配合物-HSA体系荧光光谱的影响

图10 共存离子对芳基钌配合物-HSA体系影响的实验结果图

表4 共存离子对芳基钌配合物-HSA体系键合常数的影响

Systems	Ka(105L·mol-1)	R2	S.D.	K/K0
HSA -Drug alone	3.47	0.999	0.285	1
HSA -Drug+Mg2+	2.36	0.999	0.119	0.680
HSA -Drug+Ca2+	0.77	0.994	0.726	0.221
HSA -Drug+Cu2+	0.59	0.999	0.272	0.170

3.6 芳基钌配合物与人血清白蛋白的三维荧光光谱

三维荧光光谱能够很直观的分析出人血清白蛋白的构象变化，要探究芳基钌配合物-HSA体系的构象变化，可以用三维荧光光谱来分析。

在实验过程中，HSA的浓度保持不变，加入芳基钌配合物。

图11，荧光峰1（λex/em=290.0/346.9nm）代表色氨酸残基的光谱行为或HSA的酪氨酸残基，荧光峰2（λex/em=235.0/345.7nm）代表多肽链结构的光谱行为。从表5可以看出，荧光峰1的强度从846.9降到404.5；荧光峰2的强度从548.1降到273.66。这些结果表明，加入芳基钌配合物，使HSA所处的微环境或结构发生了变化。

图11  HSA和芳基钌配合物-HSA体系的三维荧光光谱

	HSA			Drug–HSA system
	Peak position λex/em(nmnm)	Stokes shift Δλ(nm)	Intensity F (a. u.)	Peak position λex/em (nmnm)	Stokes shift   Δλ(nm)	Intensity F (a. u.)
Peak1	290.0/346.9	56.9	846.9	290.0/345.7	55.7	404.5
Peak2	235.0/345.7	110.7	548.1	235.0/343.2	108.2	273.66

表5  HSA与芳基钌配合物-HSA的三维荧光光谱特征

3.7 芳基钌配合物对HSA二级结构的影响

圆二色谱是分析HSA二级结构变化最好的方法之一，为了探讨芳基钌配合物对人血清白蛋白二级结构的影响，可以用圆二色谱来分析在不同芳基钌配合物的浓度下的HSA的圆二色谱[18]。

在实验过程中，HSA的浓度保持不变，规律的增加芳基钌配合物的浓度。

从图12中看出，HSA有两个负的吸收峰，分别为209纳米和224纳米，这是HSA的α-螺旋结构的特性吸收峰。当加入芳基钌配合物以后，圆二色谱的强度降低了，HSA的负椭圆率峰明显降低了，说明其分子结构在加入芳基钌配合物后发生α-螺旋含量减少了，HSA分子的肽链结构在芳基钌配合物的作用下有所伸展。

图12 芳基钌配合物与HSA作用的圆二色谱

4 结束语

本文利用多种光谱法探讨了芳基钌配合物与HSA的互相作用，探讨了体系的猝灭机，结果表明芳基钌配合物对HSA的荧光猝灭机理是静态猝灭。探究芳基钌配合物与HSA相互作用的结合模式，结论为芳基钌配合物与HSA间的作用力主要是氢键和范德华力。研究了芳基钌配合物在HSA上的作用位点，结果表明芳基钌配合物在HSA的作用位点在SiteⅠ位。考察了共存离子对芳基钌配合物-HSA体系的影响，结果表明离子对体系键合常数值均有不同程度的影响。通过三维荧光光谱和圆二色谱，发现芳基钌配合物使HSA的微环境发生了改变。