1 前 言
1.1 洋铁酸模
洋铁酸模[1-3] (Rumex patentia L.)，学名巴天酸模，俗称洋铁叶，多年生的草本植物。广泛分布于我国东北地区，国外分布于高加索，哈萨克斯坦，俄罗斯，及欧洲。历史悠久，资源丰富，来源广泛，采摘成本低，因其种种优点，在民间沿用已久。洋铁酸模不但具有清热解毒、杀虫止痒、通便的功效,还可用于皮肤病、各种出血、肝炎及炎症，效果明显，另外，洋铁酸模还具有较高的食用价值。洋铁酸模中的粗蛋白、粗脂肪、总磷、总糖的含量都比较高，尤其是维生素C[4]的含量很高，一般春季采食嫩叶，秋季采收种子和根部，其嫩叶及种子可食，根可全部入药。目前，虽然国内外对洋铁酸模的报道少之又少，但洋铁酸模具有的可观经济价值和潜在的市场前景是不容忽视的。
1.2 植物蛋白
蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与，是生命活动的主要承担者。蛋白质包括动物蛋白[5]与植物蛋白，动物蛋白对各种年龄层次的人都是有益的，具有改善脑力劳动者的记忆，增强体质，更有推迟衰老，防止多种老年疾病发生的作用。但是动物蛋白中含有大量的饱和脂肪与胆固醇，长期食用，会导致冠心病、高血压等疾病，不利于人体健康。植物蛋白[6-8]是一种从植物中提取的蛋白质，营养虽与动物蛋白相仿，但相比于动物蛋白更易于消化，且不含饱和脂肪和胆固醇。植物中蛋白含量高的最典型例子是大豆，大豆中蛋白质含量很高，可达40%左右，其中含有的蛋氨酸和赖氨酸是蛋白质的优秀来源，在植物中我们也可以获得相当于动物蛋白的高品质蛋白，是人类食用蛋白质的良好来源。
1.2.1 蛋白质与免疫力
我们人体的抵抗力，用术语来说就是免疫力，指机体对病原微生物的入侵和感染有抵抗能力的就是抵抗力，这种抵抗能力与人体摄入的蛋白质的质量关系密切。人体内的大多数免疫物质和组织器官的自然屏障都是由蛋白质或氨基酸[9]构成，例如，免球蛋白、细胞因子、等。其中在最容易受损伤的肺和小肠的表面，可以连续分泌粘液，这种黏液是一种糖蛋白，糖蛋白是发挥重要屏障功能的物质，这对于预防有害微生物的入侵有着至关重要的作用。近年的研究发现，蛋白质以及氨基酸还可以通过其他机制调节或机体的免疫能力，维持机体健康。
1.2.2蛋白质与抗疲劳
疲劳是全身机能的失衡或者障碍，也是身体内的组织、器官的机能或反应能力减弱造成的，它可以影响机体的整个系统。 对抗疲劳的方法，除了注意要有健康平衡的饮食习惯外，在营养均衡的基础上，还应特别注意蛋白质的供应。因为蛋白质不但是人体正常生理功能的物质基础，而且合理的蛋白质供应对于提高人体的抗疲劳能力有很大的帮助。蛋白质对贫血性疲劳、高消耗性疲劳、运动性疲劳都有很好的作用，特别是对大脑疲劳的作用，效果最好。
1.2.3 蛋白质与肝硬化
肝硬化[11]患者普遍存的问题是缺乏营养素，为了控制病情发展，供给丰富的营养素，增强患者自身抵抗能力，促进肝细胞的修复和再生是患者治疗疾病过程中食物疗法的主要目的。肝硬化病人的饮食应避免进食动物高蛋白，高蛋白饮食可使人体肠道内的产氨情况骤增，另外代谢产物含有较多的芳香族氨基酸，这类氨基酸可以在肝硬化时抑制脑神经传导而诱发肝昏迷。肝硬化患者应少量食用植物蛋白为宜，因为植物蛋白中的芳香族氨基酸较少，支链氨基酸却较多，而支链氨基酸可以拮抗部分毒性物质对脑神经功能[12]的阻断。
1.3 目的和意义
本实验提取的洋铁酸模叶蛋白属于植物蛋白，相对于动物蛋白，植物蛋白在植物细胞中产生，不但容易被人体消化吸收，还可以减低胆固醇水平，减少癌症的发生，对人体健康极其有益。本实验采用的响应面分析法，在几种因素交互作用下，分析得到提取洋铁酸模叶蛋白的最佳条件，此种方法适用于多种物质的提取工艺，在减少实验次数的同时，降低了实验成本。洋铁酸模的研究和发展在国内外屈指可数，本实验的开展也在一定程度上促进了提取工艺的发展。
2 实验材料与方法
2.1实验材料
洋铁酸模 采自于吉林农业大学植物园，经吉林农业大学生命科学学院刘洪章教授鉴定为蓼科酸模属洋铁酸模（Rumex. pafientia L.）。
2.2 实验试剂与仪器
2.2.1 实验试剂
0.1mol/L NaOH溶液
浓盐酸（分析纯，北京化工厂）
考马斯亮蓝(G-250)
2.2.2 实验仪器
T6 新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）
PH测定仪（上海佑科仪器仪表有限公司）
恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）
真空抽滤机（上海耀特仪器设备有限公司）
电子天平（上海精天电子仪器有限公司）
锥形瓶若干、试管若干、烧杯、胶头滴管、吸量管，移液枪，枪头。
2.3 实验方法
2.3.1 实验材料的预处理
采摘生长状况良好的洋铁酸模叶→清洗干净→阴凉处干燥→粉碎→过40目筛→低温储藏备用
2.3.2 蛋白标准曲线的绘制
准确称量标准牛血清蛋白50mg，加入500mL容量瓶定容，得到0.1mg/mL的标准蛋白溶液，取6支洁净的试管，依次编号，按照编号顺序依次向6支试管中加入标准蛋白0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL，再依次向6支试管中加入蒸馏水补足体积至1mL。分别向6支试管中加入5mL考马斯亮蓝，摇匀后放置5min，于595nm处测定吸光度。以蛋白含量为横坐标，OD值为纵坐标制作标准曲线，并根据蛋白质的标准曲线计算得到蛋白质的得率，如图3-1所示。
样品蛋白质含量（mg/g）=CVT/WVS （公式1）
式中：C—查得标准曲线上蛋白质含量
VT—提取的总体积
W—样品鲜重
VS—测定时的加样量
2.4 单因素实验
2.4.1 时间对蛋白得率的影响
电子天平准确称量5份1g洋铁酸模叶样品分置于5个干净的锥形瓶中，样品与0.1mol/L NaOH溶液按1:20的比例混合均匀后，用保鲜膜封口，60℃恒温水浴锅中分别浸提0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，再用真空抽滤机抽滤，抽滤得到的滤液用移液枪吸取1mL，分别吸取五份置于5个洁净的试管中，加入5mL考马斯亮蓝混合均匀后，于595nm处测量OD值。
2.4.2 温度对蛋白得率的影响
电子天平准确称量5份1g洋铁酸模叶样品分置于5个干净的锥形瓶中，样品与0.1mol/L NaOH溶液按1:20的比例混合均匀后，用保鲜膜封口，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，恒温水浴锅中浸提1.5h，再用真空抽滤机抽滤，抽滤得到的滤液用移液枪吸取1mL，分别吸取五份置于5个洁净的试管中，加入5mL考马斯亮蓝混合均匀后，于595nm处测量OD值。
2.4.3 料液比对蛋白得率的影响
电子天平准确称量5份1g洋铁酸模叶样品分置于5个干净的锥形瓶中，样品与0.1mol/L NaOH溶液按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的比例混合均匀后，用保鲜膜封口，60℃恒温水浴锅中浸提1.5h，再用真空抽滤机抽滤，抽滤得到的滤液用移液枪吸取1mL，分别吸取五份置于5个洁净的试管中，分别加入5mL考马斯亮蓝混合均匀后，于595nm处测量OD值。
2.4.4 响应面实验设计
综合考虑时间、温度、料液比三个因素对蛋白质得率的影响，并在单因素实验的基础上，设计响应面实验，以达到优化洋铁酸模叶蛋白提取条件的目的。设计如表2-1所示
表2-1 响应面因素水平表
Table2-1 The response surface of level of factor
|
水平 |
时间（h） |
温度（℃） |
料液比（mg/mL） |
|
-1 |
1.0 |
50 |
10 |
|
0 |
1.5 |
60 |
20 |
|
1 |
2.0 |
70 |
30 |
3 结果与分析
3.1 蛋白标准曲线
图3-1 蛋白质标准曲线
Fig.3-1The curve of protein standard
3.2单因素实验结果
3.2.1 时间对蛋白得率的影响
提取时间不同，蛋白的提取量不同，从图3-2中可以看出提取时间在0.5-1.5h范围内，蛋白提取量随时间的增加呈现上升的趋势，并在提取时间为1.5h的时候时，提取量最高，提取时间在1.5h后蛋白提取量呈现下降的趋势。
图3-2时间对蛋白得率的影响
Fig.3-2 Effect of time on the yield of protein
3.2.2 温度对蛋白得率的影响
在研究单因素温度对蛋白得率的影响时，在40℃-60℃的区间内，蛋白得率随着温度的上升而增加，在60℃以后，蛋白得率随着温度的上升呈现逐渐下滑的趋势，特别是温度达到80℃时，蛋白得率达到最低，可能的原因是温度过高导致部分蛋白质变性。
图3-3温度对蛋白得率的影响
Fig.3-3 Effect of temperature on the yield of protein
3.2.3 料液比对蛋白得率的影响
料液比对提取量存在影响，料液比在1∶10-1∶20范围内蛋白提取量呈现上升的趋势，在当料液比为1∶20时，蛋白提取量达到最高，而料液比在1∶20以后呈现下滑趋势。如图3-4所示
图3-4料液比对蛋白得率的影响
Fig.3-4 Effect of solid-liquid ratio on yield of protein
3.3 响应面设计方案及分析
表3-1 响应面设计结果
Table 3-1 The experiment result of response surface
|
编号 No |
A:时间（h） Time |
B:温度（℃） Temperature |
C:料液比（ml/g） Liquid to solid ratio |
蛋白质含量（mg/g） Exaction rate of protein |
|
1 |
1.5 |
60 |
20 |
5.301 |
|
2 |
1.5 |
50 |
10 |
3.491 |
|
3 |
1.5 |
50 |
30 |
4.2685 |
|
4 |
1.5 |
60 |
20 |
5.382 |
|
5 |
2 |
60 |
10 |
3.6595 |
|
6 |
1 |
50 |
20 |
4.24 |
|
7 |
2 |
60 |
30 |
3.5125 |
|
8 |
1.5 |
60 |
20 |
5.329 |
|
9 |
1.5 |
70 |
30 |
3.7715 |
|
10 |
1.5 |
60 |
20 |
5.426 |
|
11 |
1 |
60 |
30 |
4.584 |
|
12 |
1 |
60 |
10 |
3.826 |
|
13 |
1 |
70 |
20 |
4.2835 |
|
14 |
1.5 |
60 |
20 |
4.951 |
|
15 |
2 |
50 |
20 |
3.9845 |
|
16 |
2 |
70 |
20 |
3.9715 |
|
17 |
1.5 |
70 |
10 |
3.4475 |
表3-2 响应面方差分析
table3-2 The variance analysis of response
|
方差来源 |
平方和 |
自由度 |
均方 |
F值 |
P值 |
显著性 |
|
Error source |
SS |
DF |
MS |
F value |
P value |
Significance |
|
A |
0.41 |
1 |
0.41 |
10.57 |
0.014 |
* |
|
B |
0.033 |
1 |
0.033 |
0.84 |
0.3889 |
|
|
C |
0.37 |
1 |
0.37 |
9.51 |
0.0177 |
* |
|
AB |
7.98E-04 |
1 |
7.98E-04 |
0.021 |
0.8896 |
|
|
AC |
0.2 |
1 |
0.2 |
5.31 |
0.0546 |
|
|
BC |
0.051 |
1 |
0.051 |
1.33 |
0.286 |
|
|
A2 |
1.07 |
1 |
1.07 |
27.7 |
0.0012 |
* |
|
B2 |
1.8 |
1 |
1.8 |
46.78 |
0.0002 |
* |
|
C2 |
3.25 |
1 |
3.25 |
84.36 |
< 0.0001 |
** |
|
模型Model |
7.86 |
1 |
0.87 |
22.65 |
0.0002 |
* |
|
残差 |
0.27 |
7 |
0.039 |
|||
|
Residual error |
||||||
|
失拟项 |
0.13 |
3 |
0.042 |
1.19 |
0.4205 |
不显著 |
|
Lack of Fit |
||||||
|
纯误差 |
0.14 |
4 |
0.036 |
|||
|
Pure Error |
||||||
|
Cor Total |
8.13 |
16 |
（注：“*”显著P<0.05，“**”极显著P<0.0001）
从表3-1中可以得到提取洋铁酸模叶蛋白的最优条件是温度为60℃，浸提时间为1.5h，料液比是1:20,在此条件下的蛋白得率最大，最高可达5.426mg/g。从表3-2可以得出结论是F值显著，P值<0.05时则表明影响因素值显著。模型的F值为22.65意味着模型是显着的。“模型F值”只存在0.02 %的机会发生，这个大可能发生由于噪音。模型的P值小于0.0500，表明模型是显著的。在这种情况下，A，C，A2，B2, C2是显著的模型项。值大于0.1000表示模型项目是不显著的。如果存在许多不显著的模型项，模型的缩小可能会优化模型。失拟项的F值1.19意味着失拟项与纯误差的关系不明显。模型中失拟项F的发生有42.05%的机会，造成这种误差的原因，大多数情况下是噪音。没有显著的失拟项是我们所需要的模型。
