前言

　　随着人们对食品质量与安全关注程度的提高,食品加工过程中产生的一些有害物质引起了人们的高度关注[1]。我国地域辽阔,历史悠久,居民饮食消费习惯与食物的加工工艺与国外存在许多不同，因此对于我国食品加工过程中是否产生有害物质，产生机制及控制，是目前急需研究解决的课题。

　　而卤汤以其香、鲜的独特口感和风味而深受消费者的喜爱。卤汤的制作方法就是将汤进行反复熬制，让卤汤具有香浓醇正的口感和风味，然而这些加工过程虽然能给卤汤赋予独特的口感和风味，但同时也会产生对人体造成疾病的潜在物质，比如杂环胺类化合物。

　　1 杂环胺的介绍

　　杂环胺，是蛋白质含量丰富的肉制品经过高温处理后形成的一类潜在的具有致癌致突变杂环芳香族化合物,是一类带有杂环的伯胺。

　　1.1杂环胺的种类

　　杂环胺类化合物从化学结构上可以分为氨基咪唑氮杂芳烃(aminoimidazoazaren，AIA)和氨基咔啉(amino-carbolin congener)两大类。

　　AIA又分为喹啉类、喹喔啉类、吡啶类与呋喃吡啶类。喹啉类主要包含2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(MeIQ)两种;喹喔啉类主要包含2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(IQx)、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)，2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)和2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(7,8-DiMeIQx)四种;吡啶类主要有2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP);呋喃吡啶类主要有2-氨基-1,6-二甲基呋喃并[4,5-b]吡啶(IFP)。陆续鉴定出的新的化合物大多数类属于这类化合物，一般形成于100～300℃的加工温度。AIA均含有咪唑环，其上的α位置有一个氨基， 在体内可以转化成N-羟基化合物而具有致癌、 致突变活性。由于AIA上的氨基均能耐受2mmol/L的亚硝酸钠的重氮化处理，与最早发现IQ性质类似，因此AIA又被称IQ型杂环胺，即极性杂环胺。

　　氨基咔啉分为α-咔琳类、β- 咔啉类、γ- 咔啉和ζ-咔啉四类，α-咔琳类主要有2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(AαC)和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(MeAαC)两种，β- 咔啉类主要有9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Norharman)和1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Harman)两种。γ- 咔啉主要有3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-P-1)和3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-P-2)两种。ζ-咔啉2-氨基-6-甲基二吡啶[1,2-a:3',2'-d]咪唑(Glu-p-1)和 2-氨基二吡啶[1,2-a:3',2'-d]咪唑(Glu-p-2)两种。此类化合物一般是在加热温度高于300℃才产生。氨基咔啉类环上的氨基不能耐受2mmol/L的亚硝酸钠的重氮化处理，在处理时氨基脱落转变成为C-羟基失去致癌、致突变活性，因此称为非IQ型杂环胺，即非极性杂环。其致癌、致突变活性较IQ型杂环胺弱[2]。

　　1.2杂环胺生物毒性

　　杂环胺对人体的危害主要表现在它们的致突变性和致癌性。

　　1.2.1致突变作用

　　杂环胺类化合物的主要危害之一是具有致突变性。但是杂环胺是一种间接性的致突变物，需要在其他物质的活化下才具有致突变性。

　　杂环胺的活性代谢物是N一羟基化合物，后经乙酰转移酶和硫转移酶作用，将N一羟基代谢物转变成终致突变物。Ames试验表明，杂环胺在S9代谢活化系统中有较强的致突变性，其中TA98比TAl00更敏感。提示杂环胺是致移码突变物。除诱导细菌基因突变外，杂环胺类化合物还可经S9活化系统诱导哺乳动物细胞的DNA损害，包括基因突变、染色体畸变、姊妹染色体交换、DNA断裂、DNA修复合成和癌基因活化。但杂环胺在哺乳动物细胞体系中致突变性较细菌体系弱[3]。

　　1.2.2杂环胺致癌作用

　　杂环胺类化合物的另一个重要危害是致癌作用。杂环胺化合物对啮齿动物均具不同程度的致癌性，致癌的主要靶器官为肝脏，其次是血管、肠道、前胃、乳腺、阴蒂腺、淋巴组织、皮肤和口腔等。最近发现IQ对灵长类也具有致癌性[3]。

　　国际癌症研究中心将IQ归类为可疑致癌物(2A级)PhIP、MelQ、MelQx、Glu-P-1、Glu-P-2、Trp-P-1、Trp-P-2、AaC和MeAaC归类为潜在致癌物(2B级)(IARC1993)。

　　1.2.3杂环胺心肌毒作用

　　杂环胺化合物除了具有致突变和致癌外，一些杂环胺如IQ和PhIP在非致癌靶器官心脏形成高水平的加合物，研究发现，8只大鼠经口摄人IQ和PhIP2周，其中有7只出现心肌组织镜下改变，包括灶性心肌细胞坏死伴慢性炎症、肌原纤维融化和排列不齐以及T小管扩张等。另一项研究报告了对l0只做IQ慢性致癌实验的猴的心脏病理组织学检查的结果。这些猴分别摄入IQ10或20mg/kg40～80个月而患有肝肿瘤。所有动物的心脏在外观上均无改变，但有8只猴的心脏在镜下呈局灶性损伤。光镜下损伤表现为肌细胞坏死伴或不伴炎肌原纤维消失、肌节排列紊乱等。心肌损伤的严重程度与IQ的累积剂量有关[3]。

　　1.3杂环胺的形成机制

　　杂环胺类化合物依其化学结构可以分为极性(IQ型)和非极性(non-IQ型),这两类杂环胺的形成机制也不一样。极性杂环胺主要是由于肌酸/酐、氨基酸和糖类热反应生成的;而非极性杂环胺则主要是蛋白质或者氨基酸高温裂解形成的。

　　1.4 影响杂环胺生成的因素

　　1.4.1 温度和时间

　　杂环胺的形成与烹饪温度和烹饪的时间息息相关[4-5]。温度小于 150 ℃时， 杂环胺形成少; 而当温度高于 200℃，杂环胺的形成量会显著增加[4-5]。大量的研究都表明当温度低于100摄氏度时，只生成Harman和Norharman，而在200~~225摄氏度中加工的肉制品中都没有检测到热解杂环胺[6]。杂环胺在200摄氏度以上会热解明显，杂环胺含量随温度升高含量逐渐增高，且随着加热时间的增加，杂环胺的含量也显著增加。

　　1.4.2 烹饪方法和肉的种类

　　烹饪方法对于肉中杂环胺的形成有重要的影响[7]。然而在不同的肉中烹饪方法生成的杂环胺的含量也不同，在鸭胸肉中，不同的烹饪方法形成的杂环胺多少：煎>木炭烧烤>油炸>烘烤>微波>水煮，而在鸡肉中，不同的烹饪方法形成的杂环胺的多少：木炭>烧烤>油炸>锅煎>焙烤。炖、煮、蒸温度一般不超过 100 ℃，故形成杂环胺较少;而煎、炸、烧烤的温度均在 200 ℃以上，形成杂环胺含量较高;微波通过内部产热，可避免局部过热，且缩短烹饪时间，相对温和;烤箱烘烤一般不会形成高含量杂环胺。

　　1.4.3 前体物

　　IQ 型杂环胺的咪唑喹喔啉或咪唑喹啉部分来源于葡萄糖，而咪唑部分来源于肌酸，其中C-4 则来源于氨基酸的的C-2[8]，表明前体物会影响杂环胺形成。 研究发现杂环胺的形成与肌酸、葡萄糖、氨基酸的降解密切相关，且某些氨基酸如谷氨酸、异亮氨酸等可与葡萄糖反应形成杂环胺。 另有研究，在干、 湿两种模拟体系中加入肌酰，IQ 形成都增加，而 MeIQx、PhIP 只在干体系中增加;加入甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，两种体系中 MeIQx、PhIP 形成都增加;加入葡萄糖，两体系中杂环胺减少，表明葡萄糖对杂环胺形成具有双重作用[9]。 当其加入物质的量超过其他前体物时杂环胺形成缓慢，而美拉德反应产物快速形成，且直接与肌酰反应，与形成杂环胺的途径竞争。 此外，前体物受肉的类型、所在部位、老化时间等影响，应注意食材的选择与处理。

　　1.4.4 其他

　　水分和脂肪会影响烹饪过程中的传热传质，从而影响杂环胺的形成[8]。 在肉汁模拟体系中发现 DMIP、TMIP、IFP、PhIP 在干燥下加热更易形成，而 MeIQx 则倾向于潮湿下形成。脂肪是高效的传热介质，可加速食品至设定的烹饪温度，减少热暴露时间，降低杂环胺形成，因此含 30%脂肪的牛肉比含 15%脂肪的牛肉形成的 AαC 少。

　　1.5 杂环胺的检测

　　由于肉类加工品中基质复杂、杂环胺种类多、含量低，因此需要有灵敏度高的检测设备和技术。目前，食品中杂环胺的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[10-12]、气相色谱法(GC)[13]、气相色谱-质谱法 (GC-MS)[14]和液相色谱-质谱法(LCMS)[15-17]。值得一提的是高效液相色谱和质谱的联用，在分析选择性、灵敏度和专一性等方面进行了2种技术的优势互补，为杂环胺的检测提供了新的技术路线，很好地满足了当前对于肉类加工品中杂环胺检测分析的需求，是目前检测肉类加工品中HAAs 的较为精准和迅速的方法。

　　1.6 国内外杂环胺的研究进展

　　目前国外许多国家对杂环胺的各个方面进行了深入广泛的研究，比如生物毒性的监测、提取检测方法的优化、在不同品种食品中杂环胺含量的测定、不同加工方法和条件对杂环胺生成的影响、生物利用效率和代谢方式等，从而为评估其对人类健康的影响提供依据和指导。我国对杂环胺的研究从80年代后期开始，到现在仍然不是很多人研究，还处于起步阶段。随着人民生活水平的不断提高和对自身健康的广泛关注，食品安全问题已在全国乃至全球掀起了一股热潮，而加工肉制品中的杂环胺也成为了广大学者的研究目标。

　　2 高效液相色谱分析法

　　高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um 的吸附剂( 硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。

　　高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。

　　高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达29.4MPa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

　　2.1 特点：

　　2.1.1 高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

　　2.1.2 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。

　　2.1.3 高效：HPLC的分离效率高于普通液相色谱，在发展过程中又出现了许多新型固定相，使分离效率大大提高。

　　2.1.4 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般微升。

　　2.1.5 适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75%～80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

　　3 本试验的研究意义

　　国外对于肉制品中杂环胺的检测方法、形成规律、生物毒性、抑制措施等方面已展开深入研究,但是目前我国对杂环胺的研究才刚刚起步,国内也没有对食品中的杂环胺含量的国标建立。国内对于杂环胺的研究报道甚少，而有关卤汤中杂环胺的研究还未见报道。此外,由于国内外的烹饪方式、和各国人饮食习惯的不同,可能导致肉制品中杂环胺的形成和分析也有所不同,因此,本课题以卤汤为研究对象,对卤汤中的杂环胺展开了研究,以期为了解卤汤中杂环胺的含量与形成从而降低其生成量提供理论依据和参考。

　　实验部分

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器、试剂与材料

　　1.1.1仪器类型

　　超高效液相色谱(安捷伦1290)质谱( Thermo型号LTQXL )、

　　12管固相萃取装置 (日本岛津公司)

　　氮吹仪 (N150-2型上海博翔仪器设备公司)

　　氮气减压装置 (青岛YQD-09华青仪器)

　　超声波清洗机 (斯康波达机电设备有限公司)

　　高速分散均质机 (宁波生物科技有限公司 )

　　电子天平德国 (sartoriuS 型号PRACTUM224-1CN)

　　Milli-Q型超纯水器 (美国 Millipore 公司) 、

　　高速冷冻离心机(安徽中科中佳仪器有限公司型号HC-3618R)

　　1.1.2 试剂类型

　　10种杂环胺标准品(IQ、MeIQx 、PhIP，4,8-DiMeIQx、Harman，Norharman，AαC，MeAαC，Trp-P-1，Trp-P-2 )，10种标准品的纯度不低于96%(加拿大TRC公司)、硅藻土(天津市科密欧化学试剂有限公司)、Oasis MCX混合阳离子交换小柱 ( 3 mL/60 mg，美国 Waters 公司)、Bond Elut 丙基磺酸( proplysulfonic acid，PRS) 固相萃取柱 (500 mg /3 mL，美国Agilent公司 ) 、ProElutC18 固相萃取柱(500 mg /3 mL， DIKMA公司 )，乙酸乙酯(色谱纯DIKMA公司)、甲醇(色谱纯 DIKMA公司)、乙腈(色谱纯 DIKMA公司)、甲酸(色谱纯 DIKMA公司)，其他试剂都是国产分析纯类试剂。

　　1.1.3 主要试剂的配置

　　1mol/L NaOH标准溶液的配置：准确称取40gNaOH溶于干净的烧杯中，全部溶解后接着倒入1L的容量瓶中定容。

　　甲醇：氨水(19：1，V:V)：19ml甲醇和1ml氨水混合摇匀配得。

　　0.1mol/LHCl的配置：10ml 1mol/L的HCl加入100ml的容量瓶中加入蒸馏水定容。

　　1.1.4材料

　　试验材料卤汤样品采集10份(分两次购买，每次于同一个店铺购买两次，每次购买的量与种类相同，第一次购买和第二次购买相差两月)。购置于附近的农贸市场和超市，购置的样品置于-18℃的条件下保存，等待分析使用。

　　1.2方法

　　1.2.1标准溶液的配置

　　每种杂环胺标准品准确称取 1.0 mg ,分别溶于甲醇中，定容至 10 mL，得到100 mg /L的标准储备液，并保存在-18℃条件下。吸取单标储备液配置成溶度为2 ng/mL的混合标准储备液，然后逐级稀释到刻度为200、100、70、50、30、20、10、5、1、0.5 ng/mL，并且以从小到大的浓度进样。

　　1.2.2 样品的预处理

　　1.2.2.1 试验样品的处理

　　样品至购置后储藏在-18℃的条件下，分析前取出，在室温下放置2个小时，自然解冻。

　　1.2.2.2方法一

　　参考彭增起等[18]前处理方法，并稍微做一下修改。准确称取 6.00g 肉(精确到0.01g)，绞碎，置于 50 mL 离心管中，依次加入 20 mL 乙酸乙酯、1 mL 氨水及 1 mL 三乙胺混合后，与转速8000 r/min 离心10min，按上述方法重复提取2 次。合并上清液，上样于预先用5 mL 二氯甲烷活化的 PRS 固相萃取柱上，控制流速为1 ml/ min，样品全部通过 PRS 柱后，将柱抽干;依次用 6 mL 0. 01mol / L 盐酸、15 mL 甲醇-盐酸0. 1 mol / L HCl( 3∶2，v / v) 、2 mL 水将非极性 HAAs 洗脱至50 mL 试管中;混合均匀后，将混合液预先用 5 mL 甲醇和 5 mL 水活化的 C18固相萃取柱( 500 mg/3 mL) ，用2 mL 水淋洗，抽干后，再用2 mL甲醇-氨水( 95∶0.5，v/v) 洗脱，收集洗脱液于 10 mL 试管中。再将最初上样的 PRS 固相萃取柱与预先用 2mL 甲醇和 5 mL 水活化的 C18固相萃取柱( 100 mg/1mL) 串联，用 20 mL 0. 5 mol / L 醋酸铵水溶液 ( pH8. 0) 将极性 HAAs 从 PRS 柱上洗脱至 C18柱上，弃去 PRS 柱，用 2 mL 水淋洗 C18柱，抽干后用 2 mL 甲醇-氨水( 19∶1，v/v) 洗脱至6mL 试管中;洗脱液在50℃氮吹仪在吹干，然后用500 ul甲醇复溶，用 0. 45 μm针头过滤器过滤，滤液用UPLC-MS分析。

　　1.2.2.3 方法二

　　参考曾茂茂等[19]前处理方法，并稍微做一下修改。准确称取6 g的卤汤，与50 ml的NaOH的混合均匀，加入到25g的硅藻土,混合均匀。然后用90～100 ml的乙酸乙酯超声提取50min，重复一次，与转速8000 r/min 分开下离心10min。 混合上清液，上样依次用3 mL 甲醇3ml去离子水，3ml 0.1 mol/L活化Oasis MCX的小柱，待样品全部通过固相萃取小柱，流速控制在1-1.5 ml/ min后，用 3 mL 乙酸乙酯、6 m L 0.1 mol/L HCl、6 mL 甲醇淋洗。最后用6 ml甲醇-氨水(19∶1，V / V) 洗脱。洗脱液在50℃氮吹仪下吹干，用甲醇500 uL复溶，过0.45um的针头过滤器，滤液用UPLC-MS分析。

　　1.2.3 色谱条件

　　Agilent EclipsePlusC18色谱柱(2.1 mm×150mm，1.8 um)，柱温30℃，流动相A是甲酸水溶液(1:1000，V:V)，流动相B是乙腈。梯度洗脱程序：0～18min，10 % B上升为30 %;18～20min，30%上升到100%;20～23min，100%B;23～25 min，100% B下降为10%;25 min～26min，10%。进样量为5uL，流速0.3mL/min。

　　1.2.4 质谱条件

　　鞘气体(氮气)流速30arb，辅助气体(氮气)流量5arb;电喷雾电离源(ESI);正离子扫描;多反应监测(SRM)扫描模式;离子喷雾电压3.5kV，毛细管温度300℃，毛细管电压12V。

　　2 前处理优化及方法学评价

　　不同的前处理方法，对分析检测的结果差别很大，优化和选择一种合适的酱卤制品的前处理方法，对我们处理酱卤制品中杂环胺的定量研究意义重大。

　　2.1 前处理净化优化

　　2.1.1提取剂与提取体积的优化

　　2.1.1.1提取剂的选择

　　因为HAAs 结构相似，此试验选取了乙酸乙酯、环己烷、乙腈 3 种试剂作为提取剂分别按上述方法进行试验， 考察 3 种不同试剂的提取效果。结果表明， 乙腈沸点相对较高，不易吹干， 所需时间过长且回收率过低; 环己烷易与肉样中的脂肪发生乳化现象， 涡旋以后溶液呈凝胶状， 离心后也无明显效果;乙酸乙酯提取完后氮吹时最易吹干， 且杂环胺回收率高， 所以试验将乙酸乙酯选为较为合适的提取剂。

　　2.1.1.2提取剂体积的优化

　　方法一中对乙酸乙酯的提取体积60 ml 、80 ml和100 ml进行优化，经过过混合型阳离子交换小柱、洗脱、检测，最后得出的综合结论：60 ml的体积过小柱比较粘稠，容易堵塞小柱;对比100 ml和80 ml，相同处理方式下，测得杂环胺在100ml～110 ml的含量高，所以选择100 ml的体积最为合适。方法二中选择的提取剂乙酸乙酯体积为15、20、25 ml的体积，最后得出：当提取剂的体积为20 ml时，杂环胺的含量高于10、25 ml提取体积，并且20 ml的时候，样品透明、澄清，不粘稠适合最佳上样。

　　2.1.2 固相萃取小柱的选择

　　选择ProElut C18、 Bond Elut PRS、Oasis MCX的小柱，得出结论，混合阳离子交换柱干扰离子峰比较多，但是步骤比较简单。过C18和PRS小柱时，检测时纯化、重复率好、杂质峰比较少，但是步骤比较繁琐。如图一所示

　　保留时间Time 保留时间time

　　图1两种前处理方法得出的提取离子流色谱图

　　Fig. 1 chromatogram of two methods pretreated

　　2.1.3洗脱液的选择

　　为了选择适宜的洗脱条件，将100μg·L-1HAAs 的标准溶液加到 MCX 柱上， 分别 用 0. 1 mol·L- 1 盐酸、甲醇、甲醇/氨水[21]和甲醇/甲酸洗脱，并对每一步洗脱溶液进行质谱检测。结果显示，盐酸和甲醇洗脱液中未检测出任何目标化合物，而一定体积分数的甲醇/氨水、甲醇/甲酸混合溶液洗脱液检出 HAAs，表明适当体积分数的甲醇/氨水、甲醇/甲酸的混合溶液可将目标化合物洗脱下来。

　　2.1.3洗脱体积的优化

　　为了得到最佳的试验结果，本试验对试验的洗脱溶剂进行了优化，纯甲醇溶剂不能洗脱充分，试验考查了不同体积分数的甲醇与氨水、甲酸对杂环胺回收率的影响。结果表明， 使用不同体积分数的甲醇与甲酸，非极性HAAs均不易被洗脱下来;而甲醇/氨水可以很好的将HAAs洗脱下来。考察3%、5%、10%的添加水平，在空白基质中添加混合标准溶液，接着过柱子，然后用这三个水平的洗脱液进行洗脱，通过检测到的回收率和精密度得出当添加5%的水平时，洗脱效果最为充分。

　　2.2色谱条件的优化

　　2.2.1 流动相的优化

　　选择了色谱级甲酸和冰醋酸两种流动相，相同浓度下甲酸的使用可以减少拖尾的现象，峰型比较好。

　　图2 10种杂环胺标准品的提取离子流色谱图(EIC)

　　Fig. 2 EIC picture of 10 kinds of HAAs

　　Peak: 1 Norharman ;2 MeIQx;3 PhIP;4 IQ;5 Trp-p-1; 6 4,8-DiMeIQx ;7 Trp-p-2;8 MeAαC ;9 AαC;10 Harman

　　图3 杂环胺标准品Norharman的提取离子流色谱图和质谱图

　　Fig. 3 Selected ion chromatograms of HAAs standard Norharman and mass spectra

　　保留时间

　　t/time

　　图4 10种杂环胺标准品的总离子流色谱图

　　通过杂环胺的标准品的总离子流色谱图可以看出，10种标准品的保留时间都不相同，故可以通过检测样品中杂环胺的保留时间对比标准品中的杂环胺保留时间进行定性。

　　表1 10种杂环胺类化合物的定性与定量特征离子及优化的质谱参数

　　表1 Qualitative and qualitative characteristic ions and optimized MS parameters o f 10 HAAs

化合物 Compound	保留时间 Retention time( min)	母离子 Mother ion(m/ z)	子离子 Daughterion(m/ z)	碰撞能量 Collision energy
IQ	0.89	198.22	184.11*	35 35
			158.14
MeIQx	3.28	213.24	199.08* 173.10	35 35
PhIP	8.39	224.26	210.10* 183.14	35 35
4,8-DiMeIQx	5.13	227.27	213.12* 187.14	35 35
Harman	6.28	182.22	165.20* 156.14	35 35
Norharman	5.10	169.19	151.10* 141.00	35 35
AαC	9.15	183.2	167.03* 157.12	35 35
MeAαC	12.33	197.24	197.00 181.11	35 35
Trp-p-1	10.28	211.31	195.10* 119.00	35 35
Trp-p-2	8.40	197.29	181.00* 157.00	35 35

　　注：*.定量离子

　　Note: *.quantitative ion

　　2.3方法学评价

　　2.3.1杂环胺线性关系

　　线性关系，关系到定量的准确性，本试验配置成混合标准溶液，浓度是200、100、70、50、30、20、10、5、1、0.5ng/mL，以峰面积y为纵坐标，质量浓度x(μg /L)为横坐标，绘制出标准曲线。MeIQx、PhIP、4,8-DiMeIQx、Harman、Norharman 、Trp-p-1杂环胺化合物在2-200 ng/mL的线性范围良好，AαC 、MeAαC、Trp-p-2、IQ 4种杂环胺化合物在5-200ng/mL的线性范围良好，相关性都在0.99，具体数值见表2。

　　表2 10种杂环胺化合物的线性关系

　　T able 2 Linear range ,correlation coefficient and limits of detection( LOD) of 10 types of HAAs

化合物类型Compound	线性关系 Li near range(ug /L)	线性方程 Regression equation	相关系数（R2） Correlation coefficient	检出限 limits of detection
IQ	5-200	Y =76.8459X+7.89324	0.9989	0.28
MeIQx	2-200	Y =562.087X+3574.73	0.9919	0.28
PhIP	2-200	Y = 27.2461X-84.9603	0.9910	0.22
4,8-DiMeIQx	2-200	Y = 1658.99X+8943.33	0.9949	0.75
Harman	2-200	Y = 1745.43X+23745.4	0.9922	0.21
Norharman	2-200	Y = 2013.37X+3898.16	0.9984	0.25
AαC	5-200	Y = 891.361X-3981.98	0.9907	0.25
MeAαC	5-200	Y = 115.057X-61.0533	0.9988	0.6
Trp-p-1	2-200	Y =177.016X-171.982	0.9994	0.6
Trp-p-2	5-200	Y = 76.8459X+7.89324	0.9992	0.25

　　2.3.2 方法的灵敏性

　　求检出限的方法：检出限( LOD) 指的是产生一个能可靠地被检出的分析信号所需要的某物质的最小浓度或含量，在计算时被认为是产生3 倍信噪比的化合物的质量浓度值。选择一组质量浓度偏低的 10种杂环胺标准品混合溶液，按上述方法进行分析检测，计算出该方法的检出限。而定量值(LOQ)是通过色谱峰信噪比的10倍来确定的[22]。估计的检出限和定量限都是分析杂环胺的标准品得到。本试验仪器的检测标准品的检出限为1.8ng/mL，定量限为6 ng/mL。