前 言

　　亚硝酸盐有毒，可以导致人们中毒，甚至死亡，且具有致癌性已经成为人们的一种普遍认识。由此亚硝酸盐导致的食品安全问题已经成为人们关注的焦点之一。就当今社会的现况来看，亚硝酸盐属于不可替代的食品添加剂被广泛应用，而硝酸盐和亚硝酸盐又广泛存在于各类食品原料中。但在日常生活中人们并不愿意总是摄入亚硝酸盐，会十分注意食品中含有的亚硝酸盐含量是否会对人体健康造成伤害。其中剩菜作为人们日常生活中经常出现的一类含有亚硝酸盐的食品，所含有的亚硝酸盐含量究竟是如何变化的，食用剩菜是否安全，是否会对人们的健康造成影响成为大众关注的问题。

　　由于齐齐哈尔医学院食堂的管理严格规范，不存在滥用亚硝酸盐的情况，而其中所使用得食品原料都为当天购入的新鲜原材料，所以本次实验研究采用齐齐哈尔医学院食堂的剩菜进行测量亚硝酸盐含量，可以在测量剩菜中亚硝酸盐含量的动态变化过程中减少其他影响因素。为了探究剩菜中亚硝酸盐含量的总体动态变化，荤素差异、保存条件差异造成的剩菜中亚硝酸盐含量的动态变化，故特此进行本次实验研究。

　　第1章 文献综述

　　硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于自然界的土壤及水域。亚硝酸盐俗称工业用盐，亚硝酸盐是一类无机化合物的总称，也是自然界最普遍的一类含氮化合物。常见的亚硝酸盐有亚硝酸钠和亚硝酸钾(主要为亚硝酸钠)，为白色和嫩黄色结晶，呈颗粒状粉末，无臭，味咸涩，外观及滋味都与食盐相似，易潮解，易溶于水。

　　1.1亚硝酸盐对健康的影响

　　1.1.1亚硝酸盐中毒

　　亚硝酸盐具有很强的毒性，其生物半衰期24小时，摄入0.3-0.5g即可引起中毒，1-3g可致人死亡[1]。另外亚硝酸盐能够透过胎盘进入胎儿体内，人体血液中亚硝酸钠浓度为 0.4mg/kg～200mg/kg时会产生毒性，孕妇食用过量的亚硝酸钠可导致胎儿畸形，特别是六个月以内的婴儿。亚硝酸盐摄入过量会使血红蛋白中的二价铁离子氧化成三价铁离子，使正常的血红蛋白转化成为高铁血红蛋白，失去携氧能力导致组织缺氧。亚硝酸盐中毒也称为肠源性青紫症、紫绀症、乌嘴病。引起中毒的原因通常为意外误食中毒、食品添加剂滥用中毒、食用含有大量硝酸亚和亚硝酸盐的蔬菜而引起中毒、饮用含硝酸盐较多的井水中毒等。亚硝酸盐中毒发病急速，潜伏期一般为1-3小时，短者10分钟，大量食用蔬菜引起的中毒可长达20小时。中毒的主要症状为口唇、指甲以及全身皮肤出现青紫等组织缺氧表现，病人自觉症状有头晕、头痛、无力、乏力、胸闷、心率快、嗜睡或烦躁不安、呼吸急促，并有恶心、呕吐、腹痛、腹泻，严重者昏迷、惊厥、大、小便失禁，可因呼吸衰竭导致死亡[1]。轻症中毒者一般不需要治疗，重症中毒者则需要及时抢救和治疗。

　　1.1.2亚硝酸盐的致癌机理

　　亚硝酸盐本身并没有致癌作用，但可以在自然界和胃肠道的酸性环境中与次级胺，如仲胺、叔胺、氨基酸等发生反应，形成致癌物质N-亚硝胺化合物，如N-亚硝胺二甲基(N-dimethylnitrosamine，NDMA)、N-亚硝胺二乙基(N-diethylnitrosamine，DENA)、N-亚硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine，NPYR)、N-亚硝基哌啶(N-nitrosopiperidine，NPIP)、N-亚硝基二丁基(N-nitrosodi-n-butylamine，NDBA)等。N-亚硝胺化合物具有强烈的致癌作用，主要可以诱发食管癌、胃癌、肝癌和大肠癌等，目前已成为食品安全关注的焦点之一[2-5]。经常摄入亚硝酸盐有致癌的危险，亚硝酸盐在酸性条件下会分解生成亚硝酸，亚硝酸很不稳定，容易分解产生亚硝基，而亚硝基能够与人体蛋白质代谢产物仲胺类化合物结合生成亚硝胺。一次多量或长期摄入都可引起癌症，特别是胃癌。因为亚硝胺类物质合成需要在酸性条件下，而胃中含酸较多环境条件适中，目前还没有发现能耐受亚硝胺而不致癌的动物。

　　1.1.3亚硝酸盐的药用价值

　　一直以来人们都知道亚硝酸盐可以导致中毒和癌症。100年来，科学家认为亚硝酸盐没有任何益处。但是今天，美国国家卫生研究院的科学家却发现亚硝酸盐可以用来制作成药物，用来治疗镰状细胞血症和心脏病等多种疾病。科学家在研究一种与亚硝酸盐相关的化合物--氧化一氮时，意外发现了亚硝酸盐的药用价值。氧化一氮可以扩张血管，进而增加血液流量，但无法用作药物。不过，经常被用作食品防腐剂的亚硝酸盐却有着和氧化一氮相似的功效，而且可以入药，所以科学家想到了亚硝酸盐。随后，科学家进行了临床试验。他们给健康的志愿者注入微量亚硝酸盐，结果志愿者体内血液流量增加了两倍，而当志愿者运动时，体内的亚硝酸盐含量马上直线下降，说明身体正在积极使用亚硝酸盐。所以，科学家认为，亚硝酸盐可以用作药物，用来治疗镰状细胞血症、心脏病、脑动脉瘤等和血液流量有关的疾病。

　　1.2食品中亚硝酸盐的应用与应用标准

　　1.2.1食品中亚硝酸盐的应用

　　硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于日常食物和饮水中。硝酸盐和亚硝酸盐是一种常见的食品添加剂，广泛用于各种火腿、酱卤肉、熏肉和油炸肉类食品中，作为防腐剂和护色剂。亚硝酸盐能使腌肉制品呈现稳定的红色[6]，并具有独特的风味和抗氧化作用，亚硝酸盐还具有抑制肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum,简写C.Botulinum)生长繁殖的作用，从而防止肉毒毒素产生，降低安全风险。另有研究证实硝酸盐在微生物的作用下转化为亚硝酸盐也可产生上述同样作用。因此，亚硝酸盐被用作不可替代的添加剂应用在腌肉制品领域[7]。一些植物体内也含有硝酸盐，不同的品种含量不同，如绿色蔬菜中的甜菜、莴苣、菠菜、芹菜及萝卜等硝酸盐含量都比较高。这是由于农作物栽培，使用含氮农药、含氮肥料造成的。蔬菜中亚硝酸盐的产生，原料是蔬菜中的硝酸盐，转化条件主要是细菌生长。另外在经高温焖煮、加盐热炒后，蔬菜中的硝酸盐也会被逐渐还原为亚硝酸盐。芹菜、菠菜、萝卜、白菜等在腌制或浸泡过程中，所含有的硝酸盐也会逐渐变为亚硝酸盐，且随时间的延长而慢慢增加。人们饮用水中河水或者自来水中含有微量的硝酸盐,硝酸盐对人体并无害处,所以饮用无妨,但当水长时间加热，由于水分不断蒸发，硝酸盐的浓度相对地增加，而且它受热分解变成了亚硝酸盐。如果存放过久或保管不当被细菌感染，细菌大量繁殖，也可把硝酸盐转化为亚硝酸盐。其他食物如各种酒类、蘑菇、调味品、加工熏制食品、腌菜中也含有亚硝酸盐，亚硝酸盐还存在于土壤、水以及烟草的烟雾中[8]。

　　1.2.2亚硝酸盐的应用标准

　　我国肉类食品企业要严格按国家食品添加剂使用标准(GB2760-2011)规定添加硝酸盐和亚硝酸盐，肉制品中硝酸盐(包括硝酸钠、硝酸钾)使用量不得超过0.5g/kg，最终残留量(以亚硝酸钠计)不得超过30mg/kg;亚硝酸盐(包括亚硝酸钠、亚硝酸钾)使用量不得超过0.15g/kg，最终残留量(以亚硝酸钠计)在不同食品的要求不同，但大多不得超过30mg/kg[1]。我国《食品中污染物限量标准》中规定的亚硝酸盐最高限值为：蔬菜类4mg/kg，肉类3mg/kg。联合国粮农组织和世界卫生组织规定硝酸盐和亚硝酸盐的每日允许摄入量(ADI)：硝酸钾或硝酸钠0.5mg/kg，亚硝酸钾或亚硝酸钠0.2mg/kg。

　　1.3剩菜中亚硝酸盐的来源与含量变化

　　1.3.1剩菜中亚硝酸盐的来源

　　膳食是人们每天获取营养物质的正常途径,也是人们维持健康的基本保证。而亚硝酸盐作为膳食食物中自然存在的物质,每天都会随着粮食、蔬菜、鱼、肉、蛋、奶等各种食物进入我们的机体。植物生长时会利用自然界的氮合成氨基酸，在这一过程中会不可避免地生成硝酸盐，而植物体内的一些还原酶会把一部分硝酸盐还原成亚硝酸盐。在各种绿叶蔬菜中都含有不相同量的硝酸盐,尤其是如今大量使用化肥,致使菜中含有的硝酸盐越来越增多。硝酸盐本身是无毒的,但蔬菜在采摘、运输、存放、烹饪过程中,硝酸盐会被蔬菜中的某些细菌还原成亚硝酸盐。尤其是过夜的剩菜,经过一夜的盐渍,亚硝酸盐的含量会更高。酸菜和腌制的菜类中的亚硝酸盐的存在也是由于存放时间的过长和使用不新鲜的蔬菜所致[9]。有一些腌制蔬菜由于工艺的原因，会导致亚硝酸盐含量过高，而在腌菜和泡菜中，亚硝酸盐的含量会在最开始的一周内急剧升高，而在半个月后在食用则亚硝酸盐的含量会大大的降低。烹制过的菜肴中食物中的硝酸盐会被加热分解成亚硝酸盐，而加在菜肴中的调味料本身可能就含有亚硝酸盐，新鲜食用时几乎没有或含量过低并不会对人体产生影响，但在放置过后，盐渍和细菌分解会使亚硝酸盐的含量基本都增加。刚经过采收的新鲜蔬菜中亚硝酸盐的含量微乎其微。而蔬菜在室温下储藏1-3天时，亚硝酸盐的含量达到高峰;在冷藏条件下时，3-5天亚硝酸盐的含量达到高峰。而甜菜、莴苣、菠菜、芹菜、小白菜等绿叶蔬菜亚硝酸盐产生量特别大，冰箱储藏的效果要远远好于室温储藏，而且最好在两天内吃完。而对于黄瓜和土豆来说，差异并没有那么明显。冷冻储藏的变化很小。根据中国人的膳食结构来看，人体摄入的亚硝酸盐含量其中80%来源于蔬菜中。

　　1.3.2剩菜中亚硝酸盐的含量变化

　　在日常生活当中，剩菜剩饭几乎是不可避免的事情，而在外吃饭时将剩菜打包也越来越常见，在这些剩菜当中，亚硝酸盐的存在同样是不可避免的，那么其中亚硝酸盐的含量究竟是怎样变化的，会不会对人体造成伤害成为了人们关注的焦点之一。温度和时间是剩菜中亚硝酸盐含量变化的两大要素，在相同的温度条件下，存放时间越长[10]，亚硝酸盐含量就会越多;而在相同的时间内，温度更高的存放条件会使亚硝酸盐的含量增加更快。根据现有的研究结果表明，亚硝酸盐在常温下比在冷藏条件下更易产生，剩菜宜在冷藏条件下放置6小时内食用，否则6小时之后到24小时亚硝酸盐的含量将急剧上升。

　　第2章 材料与方法

　　2.1研究对象及材料

　　2.1.1研究对象

　　来自齐齐哈尔医学院5个食堂中各抽取10份总计50份菜样。

　　2.1.2研究材料(试剂与仪器)

　　1. 试剂：亚硝酸钠标准溶液(5ug/mL);0.2%盐酸萘乙二胺溶液;0.4%对氨基苯磺酸溶液;乙酸锌溶液;硼砂饱和溶液;亚铁氰化钾溶液。

　　2. 器材：分光光度计;恒温水浴箱;冰箱;电子天平;烧杯;容量瓶;胶头滴管;玻璃棒;比色管;比色管架;研钵;漏斗;移液管;洗耳球;滤纸。

　　2.2研究方法

　　2.2.1菜样分组及处理

　　将这50份菜样按食堂不同分为5组，每组10份菜样，包括5份荤菜和5份素菜。按测量条件不同再把每组10份菜样各分为2份，其中一份为常温下保存测量，另一份为冷藏下保存测量。称取经研碎的菜样5.0g置于50mL烧杯中，加入12.5mL硼砂饱和溶液，搅拌均匀，用70℃左右热水约200mL将样品全部转移到500mL容量瓶中，置沸水中加热30min，取出冷却至室温，然后边摇动边加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，混匀，静置30min，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，其余滤液用于测定。

　　2.2.2菜样检测

　　1. 将每组中20份菜样滤液分别取40mL置于比色管中，分别加入2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3min，各加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液1mL，加水至刻度，混匀，静置15min，以试剂空白为参比，于波长538nm处测吸光度，记录实验数据。重复5组测量。

　　2. 第一次取完菜样滤液后，将剩余菜样各自按常温和冷藏条件保存，之后重复按照正常食用时间每过5小时、5小时、14小时取菜样滤液，连续重复2次，将每次取得的菜样滤液都按实验第1步处理。

　　2.2.3标准曲线检测

　　取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5mL亚硝酸钠标准溶液分别置于比色管中，分别加入2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3min，各加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液1mL，加水至刻度，混匀，静置15min，以试剂空白为参比，于波长538nm处测吸光度，记录实验数据。

　　2.2.4数据处理和分析

　　调查所得数据建立数据库，制图及部分数据处理采用Excel软件，数据处理分析采用SPSS20.0统计软件。数据采用重复测量方差分析检验，P<0.05作为有显著性差异的判定标准。

　　2.2.5质量控制

　　1. 严格按照标准配制所需试剂，并注意各个试剂所需的保存条件，如避光、防潮保存等，正确使用实验仪器，认真操作，准确记录实验结果。

　　2. 宜使用数字直读型的分光光度计，以利于准确读取吸光度值。

　　3. 在部分操作中，如果室温不稳定或室温较低时，应采用控温条件进行测定。

　　4. 实验数据采用两遍单独录入的方式，用计算机加以比较，从而有效控制录入错误。

　　5. 取样与实验人员均为经过培训的专业技术人员,承担亚硝酸盐含量检测的实验室为通过国家实验室质量评定的实验室。

　　第3章 结 果