1 前言

　　1.1 传染性法氏囊病

　　1.1.1 传染性法氏囊病的研究进展

　　传染性法氏囊病(Infections bursal diseas，IBD)发病快速且死亡率高，是一种对畜禽业具有严重性危害的高度接触性的传染病。由于最早在美国的Gumboro地区发现，所以又被叫作甘泊罗病[1]。1962年Gosgrove[2]率先报道IBD，之后在我国的广东等地也发现了这种疾病。1982年周蛟、刘福致等人[3]分别于北京、上海等地的进口鸡群中分离到了传染性法氏囊病毒株(Infections bursal diseas virus，IBDV)，不久之后，IBD在我国各个地区都有发生。在防治过程中人们普遍选择疫苗来防治，不仅改变了IBDV的毒力还使其抗原性变得更强。1985年，美国发现了IBDV的变异株(Variant IBDV，vIBDV)[4]，能够离开标准株母源抗体的保护。1987年，荷兰、土耳其、比利时、南非等地均发现IBDV超强毒株(Very virulent IBDV，vvIBDV)出现的报道，这些超强株甚至够侵袭18周龄的鸡[5]。这些变异株和超强毒株有严重危害作用，它们的出现大幅度的提高了IBD的发病率和死亡率，不仅严重危害了我国畜禽业的发展，还使IBD的防治变得更加困难。2000年在治疗方面有人研究[6]发现，用高免卵黄液对IBD进行深度治疗可取得更加理想的效果。2009年罗俊等[7]对DT40细胞对IBDV弱毒株的易感性以及IBDV在其中的增值规律进行了探讨，结果发现，IBDV弱毒株能在其中大量增殖且不需要传代适应就能直接侵染。

　　1.1.2 传染性法氏囊病病毒的概况

　　IBDV是一种2个片段构成的双链、双节段病毒[8]。其A片段显示，它含有一个大型的开放阅读框(ORF)，这个阅读框可以编码一个110kDa的最初翻译产物，并可以加工成三种成熟的病毒蛋白(VP)，分别是VP2、VP3和VP4[9][10]。其中前两个是关键的结构蛋白，后者可能代表着一种病毒编码的蛋白酶[11]。RNA片段B包含着一个90kDa大小的蛋白VP1。人们一般认为VP1蛋白是RNA依赖性的RNA聚合酶[12]。IBDV对理化因素有非常强的对抗能力，另外对温度也有较强的抵御能力。在56℃下可以保留活性5h，60℃生存90min，温度70℃条件下病毒才会失去活力[13]。由于IBDV对常用的消毒液具有很高的抵抗力，所以能够持续存活在消毒过的鸡舍中。

　　1.1.3 传染性法氏囊病的病理特征及临床症状

　　传染性法氏囊病的潜伏期为3天左右，危害严重且死亡率高，不仅影响了各国养鸡业的生产效益还阻碍了畜禽业的发展前景。鸡群大多都是突然发病，发病历经1~2天时，表现为雏鸡自啄肛门，可能会引起红肿、炎症等情况，排白色或者微黄色的水样稀粪便。食欲废绝，精神不振，四肢无力，走路摇摆不稳，喜卧。伴随病情的发展，病情严重时开始出现脱水、头部下垂、眼睑闭合、衰弱等症状，发病3~4天后死亡数达到一个高峰期，7~8天后停止死亡，病愈的耐过鸡贫血、发育不良、机体免疫能力下降。病死鸡的肾脏会发生水肿而且发白，在输尿管和肾小管里可能会有尿酸盐积留现象，脾脏发生肿胀肉眼可见灰色的坏死灶。胸肌色泽变暗，大腿侧和胸部肌肉有血丝或血块状。法氏囊外面有浅黄色的凝固状物质，大小和重量变为正常的2~3倍，外形变圆，严重时呈“葡萄紫”样，一般在感染5天后，法氏囊开始逐渐萎缩、坏死，8天后体积可减小至正常水平的1/3。切开后，可见其黏膜浑浊发炎呈弥漫性出血。

　　1.1.4 传染性法氏囊病的流行特点

　　IBDV的自然宿主是鸡类，主要侵害的是3~6周龄的雏鸡，没有突出的季节性和周期性在一年的四个季节均可发生。IBD也可以侵害其他的禽类，比如火鸡、鸭、鹅等。IBD的感染率接近于100%，死亡率一般在30%左右，严重的可达到50%~70%。IBD是一种传染性很高的病毒，主要由带有传染源或者发病的病鸡传播，另外还可以由不干净的饮食、其他生物和饲养员等进行传播。IBD既可以通过呼吸道进行水平传播，又可以通过种蛋进行垂直传播，主要侵害鸡的体液免疫中枢器官-法氏囊，不仅损害其生成淋巴细胞的能力，还会减少免疫蛋白的数量，阻碍免疫功能的正常功能。IBD的侵染会发生免疫抑制现象，因为它能削弱接种疫苗的作用，让机体对其他病原等的抵抗力减弱[14]。

　　1.1.5 传染性法氏囊病的抑制免疫机制

　　由于IBDV的严重危害性，及其给国内外养殖业带来的巨大的灾难，有许多学者对IBDV在鸡体内作用机理进行研究、探索，国内外的研究结果有所不同。有些学者在研究IBDV侵染鸡后主张，其主要以侵害B淋巴细胞为主，进而抑制患病雏鸡的体液免疫功能[15]。另外也有学者认为，IBDV作用的是B细胞处于增殖状态，只有少量才会存在于未成熟的B细胞，这些细胞带有免疫球蛋白[16]。但也有报道称，IBDV作用的是没有完全成熟的B淋巴细胞。早期研究表明，IBDV的繁殖场所只有B淋巴细胞，所以IBDV的侵染不会影响其它细胞免疫。有报道称，IBDV感染雏鸡后，B淋巴细胞和T淋巴细胞的体外增值能力都有所减弱，说明IBDV对机体的体液免疫和细胞免疫都有明显的抑制作用[17]。根据大量实验表明，IBDV可能通过破坏侵染雏鸡的免疫及非免疫器官、外周血淋巴细胞(如B淋巴细胞、T淋巴细胞、吞噬细胞等)，来破坏机体的免疫防御功能。

　　1.2 线粒体的研究进展

　　1.2.1 线粒体的概况的研究进展

　　线粒体(Mitochondria)是细胞进行有氧呼吸的主要场所，是一种在真核细胞中非常重要的细胞器。其在能量代谢、生物合成和细胞死亡等生命现象中承担着关键的作用。1890年，第一次发现线粒体时，先是称为Bioblast[18]，之后改称为线粒体[19](Mitochondrion)。1948年，Kennedy E P和Lehninger A L证明了线粒体的重要性，其在三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化中均发挥者不可替代的作用。这也证明了线粒体是就是细胞进行能量转换的细胞器[20]。2009年，Smaili S等人的研究发现，衰老大鼠Bax基因转录增加及Bcl-2蛋白减少与这些动物中观察到的细胞凋亡增加相关[21]。线粒体对于细胞存亡来说是一个重要连接点，而肿胀则标志着线粒体的功能被阻碍。

　　1.2.2 线粒体的概况

　　线粒体在细胞质内，能进行独立的复制和转录，因为它有独立的DNA是一种半自主性细胞器。线粒体DNA(mtDNA)是一种共价闭合环状双链超螺旋DNA，存在于线粒体基质中，相对分子量小，基因结构简单。线粒体主要通过分裂进行增殖.首先内膜往内部凹陷，或者由其一个嵴与对面的内膜构成一个相通的嵴，让其分裂开来形成仅有外膜相连的独立的的细胞器，然后全部分开[22]。线粒体被称做真核细胞的能量供应站，产生ATP以驱动细胞的正常生理现象，是细胞活动和供能等不能缺少的，与细胞的生死密切相关[23]。线粒体是细胞死亡和凋亡的主要调控物，可能与神经相关的疾病、神经肌肉疾病的发生相关[24]。

　　1.2.3 线粒体的结构

　　线粒体存在于大多数真核细胞中且有双层膜。用电镜可见线粒体的结构且随细胞生理状况而变。一般直径0.5~1.0μm，长1.5~3.0μm。线粒体有两层膜，外膜(Outer membrane)在其外表面，厚大概6nm，平整、光滑，封闭成囊，外膜含有多种转运蛋白，它们形成较大的跨膜脂质双层，中央有孔，孔径1~3nm，允许分子量10000以内的物质自由通过;内膜(Inner membrane)是高度特化的单位膜，厚4.5nm，膜上约有60多种蛋白质占膜总重量的76%;通透性小，具有一定的通透屏蔽作用，分子量大于50的物质不能任意通过，需借助膜上的载体或通透酶。向内可形成嵴，嵴的存在可以扩大了线粒体内表面的表面积。外膜与内膜中间的空间叫做外室(Outer chamber)，与嵴内腔相通,里面有多种酶和底物等物质。内膜构成的空腔叫做内室(Inner chamber)，在这里细胞可以完成三羧酸循环。

　　1.2.4 线粒体与细胞凋亡的关系

　　线粒体产生ATP为细胞供能，并在细胞中间代谢产物的氧化、细胞内环境稳态的调节等细胞活动中发挥着重要作用[25]。细胞的编程性死亡也会受到线粒体的调控。在编程性死亡信息的作用下，线粒体的膜电位可能消失，使其物质运输改变。线粒体形态的控制因素与细胞的编程性死亡互相作用。细胞的编程性死亡最开始表现为线粒体的分裂。细胞色素C和编程性死亡调控因素等都是线粒体里可以加速死亡的物质,。这些物质可以调控细胞编程性死亡，从线粒体内传递出后用不相同的方法调控。细胞在编程性死亡信息作用下,色素C被传递到胞质内。如果细胞发生病变或损害可以通过线粒体发现，可以作为一项检测的指标，对其作用的探索是分子细胞病理学检验的关键内容[26]。

　　1.2.5 线粒体的氧化供能作用

　　线粒体对于细胞的生命活动具有非常重要的意义，因为细胞每天要产生大量ATP以供应其活动，而真核生物的有氧呼吸和形成ATP的地方是线粒体。线粒体的内膜向内折叠形成了嵴，在能量转换功能中起着主要作用.大量扩增的内膜不仅为线粒体反应提供了反应的框架，它还构成了一个空腔，可以发生很多反应。有氧呼吸有三个阶段，第一个发生在基质中，后两个阶段发生在线粒体。其中第三阶段有大量ATP的生成。

　　1.3 呼吸链

　　1.3.1 呼吸链的研究进展

　　呼吸链的发现和揭示从20世纪20年代~21世纪历经了一个多世纪。它的研究始终伴随着糖和脂肪代谢、线粒体结构和功能、氧化磷酸化偶联和ATP形成的研究。1946年.比利时科学家克劳德(A.Claude)成功分离出可供进行呼吸链研究的线粒体。由于他的分离方式会损害线粒体的功能，故不能用此方法来研究呼吸链的其它成分。尽管早在20世纪50年代科学家就证实了线粒体是双膜结构，并意识到呼吸链存在于线粒体的内膜上，但由于科学家当时把兴趣主要集中在呼吸链上，以至于到了60年代中期才发明分离双膜的方法。1979年，Chance[27]等发现，一般状况下大概有2%的氧用于活性氧的生成。超氧负离子自由基和双氧水可以产生活性氧。1996年，Xu[28]等证明双氧水可以被呼吸链氧端细胞色素c漏出的电子还原，让呼吸链可以进行自主防御，超氧自由基的代谢途径由呼吸链底物端电子漏和氧端电子漏组成。2000年，希查戈(H.Schagger)和法伊弗(K.Pfeiffer)应用Blue Native PAGE电泳技术从牛线粒体膜蛋白中分离出由复合物I、Ⅲ和Ⅳ组成的超级复合体[29]。

　　1.3.2 呼吸链的概况

　　细胞生命活动的能量大部分由呼吸链供给。呼吸链主要由NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、辅酶Q、细胞色素还原酶、细胞色素氧化酶、铁硫蛋白等组成。能量的产生由5个复合体构成的呼吸链酶完成，即NADPH-泛醌还原酶、琥珀酸一泛醌还原酶、泛醌-Cytc还原酶、细胞色素c氧化酶及ATP合成酶。除复合物Ⅱ全部由核基因(Nuclear DNA，nDNA)编码之外，其余复合物均由线粒体基因(Mitoehondrial DNA，mtDNA)和nDNA共同编码。

　　1.3.3 呼吸链的生物活性

　　线粒体呼吸链由5种酶复合物组成。复合物I位于线粒体呼吸链的首位，相对分子质量大约900000，将电子从NADH传至电子受体泛醌(辅酶Q，Coenzyme Q)，同时发生质子的跨膜输送，在ATP的生成过程中起重要作用。复合物I的损害或缺失经常造成多方面的问题，特别是生命活动中需要消耗大量ATP的器官，如对大脑的损伤，可能引起精神发育迟滞、运动障碍、共济失调、呼吸困难;心脏损害，引起心肌病、传导阻滞、心律失常;肾损害，可导致肾小管间质病、糖尿病;肝损害，导致肝脏衰竭;眼科异常，导致眼外肌麻痹、斜视、白内障、视网膜病变等[30-31]。线粒体复合体Ⅱ，是一个完整的膜蛋白质复合体，存在于各种需氧生物体中，其构成成分是两个多肽。氢不参加其在呼吸链电子的传递，只把琥珀酸的电子从FAD传达给CoQ。复合物Ⅳ又称细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase)，通过二聚体的方式呈现。主要功能是将电子从细胞色素c传递给O2 分子生成H2O。

　　1.3.4 呼吸链的调控机制。

　　当线粒体外的作用因子发生变化时线粒体的数量和功能也会变化。这些作用因子有，饮食、辐射刺激、外界温湿度、年龄增长、氧气不足等。线粒体转录因子是其基因组和核基因组的联系纽带。核转录因子的出现促进了对胞核作用于线粒体呼吸作用方式的研究。呼吸链亚基的表达受到很多因素的影响，由核转录因子在核基因组与线粒体基因组之间的相互作用来调节，然后影响线粒体呼吸链作用的变化[32]。一方面线粒体呼吸链的作用和其亚基的表现联系紧密，另一方面线粒体的能量代谢也和其呼吸链的功能联系紧密。

　　1.4 本研究的目的和意义

　　本实验通过分离IBDV野毒株感染发育正鸡胚，取其尿囊液感染DT40细胞，培养后分离线粒体，检测其线粒体NADH、NAD+含量、呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶的活性及ATP水平，来研究IBDV感染DT40细胞对线粒体呼吸链的影响，为今后研究IBDV感染对鸡细胞NADH呼吸链的影响奠定基础，具有非常重要的意义。

　　2 材料与方法

　　2.1 实验材料

　　2.1.1 实验试剂

　　辅酶I NAD(H)试剂盒、线粒体提取试剂盒、线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性比色法定量检测试剂盒、ATP含量测试盒生产于南京建成生物工程研究所。Bradford蛋白浓度测定试剂盒生产于上海碧云天生物技术有限公司。

　　2.1.2 实验动物及病毒

　　试验所用鸡胚购置于洛阳市五龙沟散养户，为非免疫鸡胚;IBDV为本实验室分离的XA2004-E4鸡胚毒，ELD50为10-7.40/0.4mL。DT40细胞系为本实验室保存。

　　2.1.3 主要培养基和配制的试剂

　　DT40细胞全培养基：为含10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、50μmol·L-1的p巯基乙醇、100 U·L-1氨苄青霉素以及50mg/μL链霉素的RPMI-1640，培养基及血清均为Gibco公司产品。

　　PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、Na2HPO4·12H2O 3.628g、KCl 0.2g、K2HPO4 0.24g，溶于950mL超纯水，调整pH值至7.0～7.2，定容至1000mL，4℃保存备用。

　　2.1.4 主要实验器材

　　DYY-III Nichipet EX 微量移液枪，日本-立洋公司;高压灭菌锅、SIGMA1-15高速台式离心机，德国-Sigma公司;超低温冰箱U410，美国-New Brunswick Scientific (NBS)公司。全自动孵化器和照蛋器，北京-方通孵化器厂;超净工作台(苏净集团安泰公司制造);酶标仪(上海迅达医疗仪器公司);电热恒温水浴锅(江苏常数医疗器械厂H.H.S);电热恒温培养箱(长沙医疗器械厂HH.B11-1);