2.2 方法

　　2.2.1 用IBDV攻毒鸡胚

　　(一)鸡胚分组和孵育。选择10枚发育正常的非免疫鸡胚，5枚为实验组，5枚为空白对照组，置于恒温孵化器中培养。在孵育的过程中不要擦洗鸡胚，以免其受到细菌的污染。孵育温度宜为37.5～38.5℃，同时要记得给温箱中的盛水器及时加水，使温箱内空气相对湿度的保持在40%～70%之间。另外培育期间防治温度过高或湿度过低，这样都会影响气室的正常发育。每隔一段时间对鸡胚转动一次，使胚胎发育良好和提高胚胎质量。

　　(二)IBDV病毒接种鸡胚。鸡胚发育至9～11日龄后，对照检过的鸡胚，在气室边界和胚胎位置做出标记，标记位置于胚胎面气室上方靠近边界处，注意避开血管。对实验组进行以下操作，用碘酒对标记处的卵壳进行消毒，随后在之前标记的地方钻一个小孔，用碘酒消毒后将注射器针头通过小孔刺入尿囊腔内，注入0.2mL IBDV病毒液，最后将蜡融化，封住小孔。放在37.5～38.5℃的全自动温箱内孵育72h，每隔6h进行照检，弃掉24h内死亡的胚胎。

　　(三)收取鸡胚尿囊液。IBDV攻毒后的鸡胚，孵育72小时后提取尿囊液。超净工作台紫外灯灭菌10min后进行操作，将鸡胚气室朝上用镊子敲开，沿着气室边界去掉蛋壳，操作过程中注意无菌操作。然后用微量移液枪吸取尿囊液，低温保存备用。

　　2.2.2 DT40细胞的复苏及攻毒

　　(一)对DT40细胞进行攻毒之前，先进行复苏。将冻存的DT40细胞用RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清)培养复苏，连续传代2~3次进行细胞复壮，然后在37℃条件下C02培养箱中培养72h。

　　(二)用尿囊液对DT40细胞进行攻毒。传代培养的DT40细胞先用灭菌PBS缓冲液洗涤2次，计数后按每组2×106个细胞分为4组接种于细胞瓶，随机分别两组，一组两瓶。一组为实验组用200μL稀释的IBDV于37℃孵育30min，二组为对照组用200μL PBS替代病毒液。30min后，用PBS洗涤2次。然后每组分别用10mL含10%FBS的RPMI-1640培养基悬浮接种于细胞瓶，37℃培养。

　　(三)收毒待检。于接毒后分别于24、48、72、96h取样，即每24h进行一次半量收毒(收集5mL细胞培养物后再添加5mL新鲜全培养基继续培养)，每次取样时将实验组(对照组)收集的细胞培养物混合并标记B、C、D、E组(对照组标记为A组)，然后用移液管分别吸取30μL用细胞计数板进行细胞计数。

　　2.2.3 线粒体NAD+和NADH含量的测定

　　用辅酶I NAD(H)试剂盒检测NAD+和NADH含量，先进行NAD+的检测。用移液管分别吸取A、B、C、D、E组30μL细胞培养物用细胞计数板进行细胞计数。然后各吸取0.5mL到离心管内2000rpm，离心5min，弃上清，按照细胞数量(104个)：酸性提取液体积(mL)为500:1的比例(建议500万细胞加入1mL酸性提取液)，超声波破碎1min(冰浴，强度20%或200W，超声2s，停1s)，煮沸5min(盖紧，以防水分散失);冰浴中冷却，10000g 4℃离心10min;取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。分别吸取上清液50μL于1.5mL的EP管中。然后分别加入250μL的试剂一，75μL的试剂二、三和四，35μL的试剂五，然后在A组中加入500μL的试剂六，混匀，室温避光静置20min。20min后在测定管中分别加入500μl的试剂六，充分混匀，静置5min后，20000g常温离心5min，然后弃上清，取沉淀，然后分别加入1000μL试剂七。混匀，用酶标仪在波长570nm处，测定各管的吸光值并记录。(NADH含量的测定只需将碱性提取液换为酸性提取液，酸性提取液换为碱性提取液。)

　　2.2.4 线粒体呼吸链复合物I活性的测定

　　先准备培养细胞线粒体裂解匀浆。分别吸取各组细胞培养物30μL，用PBS洗涤一次细胞后计数。各组再分别吸取30μL2000rpm，离心5min，弃上清收集细胞。加入1.5mL预冷的裂解液重悬细胞，冰浴放置10~15min。然后将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，冰浴的过程中用研杵研磨细胞30~40次。(显微镜下观察未裂解细胞应在50%左右)，将细胞匀浆物转移到预冷的离心管中，4℃，800g常温离心5min。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底，上清液待用。在另一个新的预冷的离心管中预先加入0.5mL溶液A，然后取0.5mL上清液(溶液A:上清液体积=1:1)加入含有溶液A的离心管中，覆盖于溶液A的上层。4℃，15000g离心10min。离心后的上清为胞浆成分，将上清转移到新离心管，作为胞浆待测样品。沉淀则为线粒体。往沉淀中加入0.2mL的漂洗液重悬线粒体沉淀，4℃，15000g离心10min，弃上清。用储存液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。(加入储存液体积：100μL/5×107个细胞)，作为线粒体待测样品。

　　然后用线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒检测。实验开始前，将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;缓冲液室温预热;反应液和底物液注意避光。先将待测样品置于冰槽里。设定好分光光度仪(温度为30℃)，波长设为340nm，间隔30s，读数7次(共3min)，并置零。移取390μL缓冲液到新的比色皿，加入50μL反应液，加入10μL底物液，放进30℃培养箱里静置3min，加入50μL阴性液，上下倾倒数次，混匀(限定在3s之内)，即刻放进分光光度仪检测并记录，此为背景空对照读数。然后进行样品总活性测定，移取390微升缓冲液到新的比色皿，加入50μL反应液，加入10μL底物液，放进30℃培养箱里静置3min，分别加入50μL待测样品，并标记。上下倾倒数次，混匀(限定在3s之内)，即刻放进分光光度仪检测并记录，此为样品总活性读数。然后测样品非特异性活性，移取380μL缓冲液到新的比色皿，加入50μL反应液，加入10μL专性液，加入10μL底物液，放进30℃培养箱里静置3min，分别加入50μL待测样品，并标记。上下倾倒数次，混匀(限定在3s之内)，即刻放进分光光度仪检测并记录，此为样品非特异性活性读数。

　　2.2.5 线粒体蛋白测定

　　用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒操作，完全融化蛋白标准品，取10μL用PBS稀释标准品稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20ul，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μL，需加标准品稀释液补足到20μL。各孔加入200μL G250染色液，室温放置3-5min。在595nm下测定各组吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。

　　2.2.6 ATP含量的测定

　　用碧云天生物技术公司生产的ATP含量测定试剂盒进行线粒体ATP含量的测定。按以下表操作以后，混匀室温静置5min，在636nm处0.5光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。

	空白管	标准管	测定管	对照管
1mmol/L标准液（μl）	30	30
样本（μl）			30	30
试剂一：底物液（μl）	100	100	100	100
试剂二：底物液（μl）	200	200	200	200
试剂三：促进剂（μl）		30	30
双蒸水（μl）	30			30
混匀，37℃水浴30分钟
试剂四：沉淀剂（μl）	50	50	50	50
充分混匀后，4000rpm离心5分钟，取上清液300μl进行测定
样本上清液（μl）	300	300	300	300
试剂五：显色液（μl）	500	500	500	500
混匀，室温静置2分钟
试剂六：终止剂（μl）	500	500	500	500

　　3 实验结果

　　3.1 IBDV感染DT40细胞线粒体中NAD+、NADH的含量。

　　用辅酶I NAD(H)试剂盒检测各组DT40细胞的线粒体NADH和NAD+的OD值，并根据对照组与测定组的OD值分别计算NADH和NAD+含量，并计算NADH与NAD+的比值并做图，如图1和图2。计算公式如下：

　　NADH含量(n mol/104cell)=(A对照-A测定-0.099)×0.1444。NAD+含量(n mol/104cell)=(A对照-A测定-0.065)×0.0988。

　　图1 IBDV感染DT40细胞线粒体中NADH、NAD+含量的变化

　　图2 IBDV感染DT40细胞线粒体中NADH/NAD+比值的变化

　　3.2 IBDV感染DT40细胞线粒体呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶的活性。

　　用Bradford蛋白浓度测定试剂盒并根据蛋白标准品的浓度与OD值,作出标准曲线的直线回归方程式y=0.63717x-0.30171，计算各组的蛋白浓度。并用线粒体呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶活性比色法定量检测试剂盒测定各组线粒体呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶的读数，计算其活性，作图如图3。计算公式如下：

　　样品活性总活性=(样品读数-背景空对照读数)×10÷0.62÷样品蛋白浓度。

　　样品非特异活性=(样品读数-背景空对照读数)×10÷0.62÷样品蛋白浓度。单位为微摩尔NADH/分钟。样品特异活性=样品总活性-样品非特异活性。

　　图3 IBDV感染DT40细胞线粒体呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶活性的变化

　　3.3 IBDV感染DT40细胞线粒体ATP的含量。

　　用ATP含量测定试剂盒检测各组线粒体ATP的OD值，按下面公式计算各组线粒体ATP的含量并做图，如图4。

　　ATP浓度(umoL/gprot)=(测定OD值-对照OD值)-(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(1×103umoL/L)×样本测定前稀释倍数×待测样本蛋白浓度(gprot/L)，。

　　图4 IBDV感染DT40细胞线粒体ATP的含量

　　4 讨论

　　在真核细胞中线粒体非常重要，是有氧呼吸的重要部位，在细胞能量代谢[33] 、生物合成和细胞死亡等调控中起关键作用。线粒体呼吸链能够传递电子，在细胞的能量供应中呼吸链起着至关重要的作用。本实验通过用IBDV尿囊液感染DT40细胞在37℃条件下C02培养箱中培养，取培养物并分离线粒体，用辅酶I NAD(H)试剂盒、线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性比色法定量检测试剂盒检测线粒体NADH、NAD+含量和线粒体呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶的活性，从NADH/NAD+的比值和线粒体呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶活性的变化来检测IBDV感染DT40细胞对线粒体呼吸链的影响。NADH/NAD+的比值越高说明细胞呼吸耗氧量越高，细胞的糖酵解和三羧酸循环的强度越大，产生的能量越多，即细胞的活动越旺盛。实验结果表明，在IBDV感染DT40细胞前期大概培养24h左右，这个时候IBDV增值需要大量能量，虽然此时线粒体内NADH/NAD+比值稍微升高，但此时呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶的活性受到抑制，线粒体产生的ATP减少。当培养时间延长至48h左右时，随着IBDV在细胞内的作用，线粒体内ATP含量逐渐回升，线粒体内NADH/NAD+比值继续小幅度升高，但呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶的活性仍然受到抑制。培养至72h后，细胞逐渐适应IBDV的侵入，虽然复合物I NADH-辅酶Q还原酶活性和线粒体内NADH/NAD+比值大幅升高，但此时细胞已受到损害且IBDV的增值活动减弱，线粒体内ATP含量逐渐降低。96h后IBDV的增值减弱且细胞受损生命活动减弱，线粒体复合物I NADH-辅酶Q还原酶活性和其NADH/NAD+比值降低且ATP含量减少。2003年，研究发现病毒感染可在短期内致心肌线粒体结构改变肿胀、囊泡化、甚至溶解破坏,对细胞的降解和凋亡起关键作用[34]。对本实验结果分析显示IBDV感染DT40细胞会抑制线粒体呼吸链的作用。本实验为今后研究IBDV感染对鸡细胞NADH呼吸链的影响奠定基础。

　　5 结论

　　本实验通过IBDV感染DT40细胞，对线粒体NADH/NAD+的比值和线粒体呼吸链复合物I NADH-辅酶Q还原酶活性进行测定，结果表明IBDV感染DT40细胞后DT40细胞先是适应病毒的感染在培养前期线粒体NADH/NAD+比值逐渐升高，复合物I NADH-辅酶Q还原酶活性增强。随后细胞的正常生命活动受到抑制，线粒体复合物I NADH-辅酶Q还原酶活性和其NADH/NAD+比值降低及ATP含量均减少，说明IBDV感染DT40细胞后线粒体呼吸链的作用受到了抑制。本实验为今后研究IBDV感染对鸡细胞NADH呼吸链的影响奠定基础。