文献综述

　　随着近代全球经济的飞速发展，以及工业化、现代化进程的不断推进，超重和肥胖在全球广泛流行并呈现快速上升趋势，不仅在发达国家，在发展中国家也呈现快速增长的势头。1980年以来，世界肥胖症人数已翻了一番。当时根据世界卫生组织估算，2008年20岁及以上的成年人中将有超过14亿人超重，其中近3亿女性和2亿多男性为肥胖。如今这已经成为了现实。肥胖不仅是一种疾病，也是一种危险因素。超重和肥胖可导致包括心脑血管疾病(心脏病、脑卒中)、2型糖尿病、肌肉骨骼疾病(骨关节炎等)、消化系统疾病(胆囊疾病)及某些癌症(子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌)在内的诸多疾病、并发症及过早死亡。因此，当下社会对肥胖的预防和控制刻不容缓。

　　2008年，美国著名学者罗伯特和中国河北医科大学专家张会志收集整理了大量国内外的试验资料[1]，指出直接干预已成年肥胖患者的治疗，过程繁琐冗长且效果甚微。如何另辟蹊径从另一角度预防肥胖成为学者研究的新方向。

　　国内外专家经过周密的观察研究发现，对于出生后1岁内尤其6个月以内的婴儿，其生长发育主要受营养控制，遗传因素及生长激素依赖性的调控作用并不显著，即使出现生长激素缺乏者在此期间亦不会表现出明显的生长迟滞。换言之，任何直接或间接影响营养的因素对体格生长的影响会甚于其后任何时期。因此，新生儿的营养状况如何会对远期体格大小有显著影响，正印证了1998年Lucas提出的“营养程序化”。这为研究孕期能量摄入与子代成年肥胖提供了可能。

　　本研究从限制孕期能量摄入量入手，通过孕期低能量膳食与正常膳食的对比，探究UCP3基因在孕鼠低能量膳食喂养的条件下对子代成年肥胖的影响。本文将就这一方向作出综述。

　　一、中国成人肥胖流行现状

　　2013年，有国内学者[2]对我国成人超重肥胖流行现状、变化趋势及健康危害做了较为详细系统的研究。2010年我国18岁及以上成人肥胖率为12.0%。随着年龄升高，肥胖率呈现在自18-24岁年龄组开始先升高而在45-49岁后呈下降的趋势。城市、农村人群肥胖率分别为13.7%，11.0%。

　　2004、2007、2010年中国18-64岁成人的肥胖率分别为7.2%、7.7%和12.1%，其中女性为8.1%、8.7%和11.7%，男性为6.3%、6.7%和12.5%，2004-2010年成人肥胖率平均每年增长速度为9%。2010年，中国成人超重肥胖比已经从2004年的3.6:1发展为2.6:1。

　　总体上，肥胖、向心性肥胖患病率分别为9.82%和34%。女性的全身性肥胖、向心性肥胖患病率分别为11.55%，37.68%，远高于男性的8.17%和30.51%。

　　而超重、肥胖人群的心血管代谢性疾病及其危险因素聚集流行普遍显著高于体重正常人群。肥胖人群中有18.3%的人患有糖尿病，远高于正常体重组(6.2%)。肥胖的人群47.6%中的人有心血管代谢性疾病聚集，男性为52.1%，女性为43.0%。不论男女，肥胖组心脑血管代谢性疾病聚集的比例均显著高于正常体重组。

　　从以上数据可知，近年来中国成人肥胖患病率呈快速增长趋势，尤其在中国成年人群中，随着WHR的增高，高血压、糖尿病、血脂异常等均随之增加。因此，探究在生命早期对肥胖的研究和干预，改善膳食结构，调整生活方式，对肥胖以及肥胖相关疾病的预防和治疗都起着极为重要的作用。

　　二、生命早期营养对成年后肥胖的影响

　　1991年，Lucas[3]率先提出“代谢程序化(metabolic programming)”的概念，指出生命在早期(胎儿期、哺乳期)通过分子、细胞、生化水平的适应对外界刺激作出反应，这种反应会持续改变机体生理代谢，即使这种反应消失，影响仍然继续存在并有可能对成年后产生影响(导致一些疾病的发生等)。继而Barker[4]等在1992年“胎儿源”假说，认为冠心病等疾病可能源于胎儿并且是一个漫长的“程序化”过程。1998年，Lucas[5]将生命早期的营养状况对成年疾病的代谢程序化作用进一步定义为“营养程序化”。随着深入的研究，人们逐渐认识到营养程序化的敏感时期不仅局限于胎儿期和哺乳期—可能会延至断乳后早期。2005年，Armitage[6]等提出出生后的营养状况对机体发育代谢有可塑性的程序化影响。随着这些学说和观点的逐渐演变和进展，研究者们主要以生命早期能量和各营养素摄入失衡为重点入手，用动物实验和流行病学调查来进行研究。

　　1.早期营养过剩对成年后肥胖的影响

　　目前为止，大多研究都是从调查出生体重和成年后BMI的关系的角度来论证早期能量摄入水平与后期肥胖的关系。如Parsons等[7]对10683例33岁成人调查发现，出生体重与成人BMI的关系呈J型曲线。即出生体重越高，成年后出现的肥胖可能性呈指数性升高。Fall等对297例60-71岁的女性调查发现，出生体重与成人BMI呈J型或者U型的曲线关系。Ong等在英国对14541名出生4个月后婴儿进行队列研究，发现婴儿早期能量摄入过多，极易导致成年后体重超重或肥胖。国内也有学者[8]通过动物实验，发现高能饲料喂养孕鼠所产子鼠体重明显高于正常喂养组的子鼠体重，并且前者在12周龄时出现了腹性肥胖。通过以上资料显示，我们可以得出结论，生命早期能量摄入过多可增加后续肥胖的危险性。

　　2.哺乳期低能量摄入对子代肥胖的影响

　　人体营养物质的失衡对代谢调节程序化的影响研究目前正处于起步阶段，流行病学和动物实验研究结果都提示肥胖的程序性发展可能发生在婴儿期、甚至胚胎期。母乳又是生物在这个时期主要的能量来源，因此，从限制哺乳期母乳摄入量(限制早期能量摄入)入手，有可能实现预防成年后肥胖的发生。

　　2015年，商丘一学者为研究哺乳期摄入低能量膳食对机体生长发育的影响，用大鼠进行相关实验。他将新出生的雄性仔鼠随即分成低能量组与正常对照组，母乳喂养并每日测量小鼠体重，21天断乳后称重处死，计算体脂含量。经计算分析后发现：哺乳期低能量膳食确可降低体重与体脂含量，并延迟牙齿生长影响生长发育。这为我们从基因层面入手研究孕期低能量膳食与后续肥胖的关系提供了理论基础。

　　3.早期蛋白质摄入水平对后续肥胖的影响

　　关于生命早期蛋白质摄入不足影响出生后生长发育和代谢的改变的研究比较多。Desal等建立蛋白质缺乏的动物实验模型：在总能量摄入一定的条件下，实验组在孕期和哺乳期用蛋白80g/kg的饲料喂养，对照组为200g/kg。断乳后恢复正常喂养就观察到11个月，发现哺乳期低蛋白喂养的子鼠出现永久性发育迟缓，而仅孕期低蛋白摄入的母鼠所生子鼠并不对以后的体格有长远影响。另一项研究发现，妊娠期低蛋白摄入受限母鼠所生子鼠的体重远低于正常对照组子鼠体重，但前者在出生后予以正常能量母乳喂养，其体重会呈现“赶超”现象，并在第七天开始持续性的超过对照组小鼠，提示出生前蛋白摄入受限的机体在出生后恢复正常能量喂养易导致肥胖。

　　而生命早期蛋白质摄入过多对后续肥胖的影响也存在争论。Hoppe等对丹麦儿童的队列研究表明，儿童在9个月和10岁时蛋白质摄入水平与其体重呈正相关，但与其体脂含量和BMI不存在必然的联系。该研究认为生命早期的蛋白质摄入水平与肥胖发生的可能不存在因果关联。但是，Gunther等对人群的前瞻性研究发现，出生后12个月和5~6岁摄入过多的动物蛋白(特别是乳蛋白)会增加成年患肥胖的风险。

　　4.早期碳水化合物、脂肪摄入水平对后续肥胖的影响

　　生命早期碳水化合物摄入水平对后续肥胖的影响也已有研究。Kaneko等在动物实验研究中发现，总能量摄入不变的情况下，将新生小鼠分成4组，分别用20%，40%，60%和80%碳水化合物饲料喂养，到第25周时20%组的小鼠体重高于40%组，40%组又高于60%组和80%组。提示低碳水化合物(高脂肪)摄入比高碳水化合物(低脂肪)摄入更易导致肥胖的发生。Srinivasan等将孕鼠在妊娠期间持续给予以油酸、亚油酸、棕榈酸和亚麻酸为主的脂肪饲料喂养，发现其所生雄性子鼠今后无论给予正常喂饲还是高蔗糖喂饲，其成年后的体重、血糖、

　　甘油三酯和胰岛素水平明显高于对照组(正常喂饲)孕鼠所生的小鼠，并提示这种代谢性改变会对成年后肥胖发生起到程序化作用。目前为止，研究者们对生命早期高脂高能膳食摄入导致体重增加并持续影响到成年的结论，形成了较为一致的共识。

　　5.早期微量营养摄入水平对后续肥胖的影响

　　关于早期微量元素的摄入水平对后期代谢影响的研究目前较少。Venu等在动物研究中发现，在总能量摄入不变的情况下，对母鼠孕期和哺乳期维生素(包括维生素A、B6、B12、C、D、E、K1、烟酸、泛酸、叶酸、硫氨酸、核黄素、生物素)摄入量限制在正常水平的50%，其子代出生后体脂含量、甘油三酯增加并可能改变体质构成。又有研究发现，母体孕前长期维生素缺乏不一定影响子代出生后的体重，但是这种情况一直持续到生产后，却可能增加子代成年肥胖、胰岛素抵抗等代谢性疾病的易患性。目前，早期微量元素摄入水平对后续肥胖的影响究竟如何尚有争论，并且缺乏更有力的动物实验证据和流行病学调查。

　　UCP3基因的研究进展

　　解耦联蛋白(UCPs)家族是线粒体阴离子转运体超家族中的一个亚家族，定位于线粒体内膜上。1997年，Boss等在棕色脂肪组织中发现了UCP3蛋白。同年，人类的UCP3基因克隆成功，它定位于11号染色体(11q13)上，碱基长度约为85kb，在5’端有一个不翻译的外显子。UCP3在骨骼肌中选择性高表达，在人的骨骼肌中，UCP3基因的最后一个内含子中有一个卵裂和多聚腺苷酸信号(AATAAA)，它可以提前终止DNA复制的延伸，因此人骨骼肌中不仅有长链UCP3(312个氨基酸)，也有短链UCP3(275个氨基酸)。除了骨骼肌，UCP3基因在心脏、肾脏、脂肪组织、皮肤等组织和器官中也有表达。

　　人们对UCP3的基因的生物学功能尚存在较多争议。一说认为其有产热功能。1961年，英国学者Peter Mitchell提出化学渗透假说，揭示了氧化磷酸化的偶联机制：电子传递链在将电子传递给氧的过程中，将质子从线粒体基质转移到内膜外从而在内膜两侧形成质子梯度，与内膜电位梯度共同构成质子电动势驱动三磷酸腺苷合酶跨膜转运，催化ATP的合成。但是，氧化磷酸化不可能完全耦联，质子会通过两种途径返回到线粒体基质：一是通过三磷酸腺苷合酶，二是通过质子漏漏回到基质。而UCPs是质子漏的主要通道蛋白，其中UCP3mRNA主要分布在骨骼肌的线粒体内膜，它引起质子经质子漏回漏增加，使呼吸链中的氧化与磷酸化作用解耦联导致ATP合成效率下降，并将贮存的能量以热能形式释放。但后来的研究发现，UCP3虽然能高度激活质子转运，但需要特殊的催化剂。Arsenijevic等认为由于UCP3和UCP1高度同源，因此两者的产热机制类似。他在UCP1剔除小鼠中注射β3激动剂，发现产热反应减弱，而在UCP3剔除小鼠中却没有这种变化。Mills等用3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺处理的小鼠肌肉和直肠温度迅速增加，而UCP3剔除小鼠没有这种变化。Echtay等发现用过氧化物或烯醛可以激活UCP3介导的质子漏回漏，提示生理性激活剂或药物介入在体内有可能激活UCP3的产热功能。现在较为一致的看法是UCP3基因在正常情况下不参与产热，但在特殊情况下有明显的生热作用[9]。

　　另有学者提出UCP3不仅产热功能，还具有控制活性簇氧(ROS)的产生和脂质代谢的能力。Echtay等认为，4羟壬烯醛等脂质过氧化物可激活UCP3介导的质子漏，降低线粒体膜电位，减少ROS的产生。ROS的减少会减少脂质过氧化物产物的产生，从而起到抗氧化损伤的作用。而氧化损伤是与衰老、缺血、糖尿病、肿瘤等多种疾病有关危害人体健康的严重问题，因此这一观点受人格外关注。Schrauwen则提出，UCP3是通过输出脂肪酸阴离子，防止基质中脂肪酸阴离子堆积，保护线粒体，从而起到防止脂肪酸过氧化和促进脂肪酸代谢的作用。输出脂肪酸阴离子也可以降低线粒体膜电位从而减少ROS的产生。

　　有很多实验和数据可以表明UCP3有脂质代谢功能(如大鼠皮下脂肪减少与皮肤UCP3上调有关[10])，因此人们愈来愈关注研究UCP3与肥胖和糖尿病等的关系。UCP3过表达的小鼠与野生型小鼠比体重较轻，且空腹血糖值下降，葡萄糖清除能力增加。但UCP3基因究竟与肥胖和糖尿病具体有何种关系，现阶段的研究寥寥无几，尚需进一步的探索和证明。

　　通过以上阐述，我们对UCP3的功能和生理意义有了一个较为全面的认识。目前探明UCP3能从线粒体基质中输出脂肪酸阴离子或脂质过氧化产物的能力，减少ROS产生，进一步减少氧化应激、脂质衍生物和线粒体破坏，从而起到增强细胞活力和机体代谢适应性的作用。很多因素调节UCP3的表达及活性，其中具体机制仍不清楚，但提示通过调节UCP3可能为治疗相关疾病(如肥胖症、糖尿病、癌症等)开拓新的领域。

　　当前存在的问题与发展趋势

　　当今社会，成人患肥胖疾病越来越多，肥胖已成为全球不可忽视的公共卫生问题。但是，大部分人的注意力都集中在如何治疗已患肥胖，但由于肥胖群体基数已过于庞大，仅仅直接干预或治疗成人肥胖经济负担严重，过程漫长且效果甚微。所以，从生命早期干预入手，从“根源”上阻止过多肥胖的形成会成为今后社会预防和治疗肥胖疾病的主要手段。目前我们已经知道妊娠期低能量的摄入有可能预防子代成年的发生，但孕期母体能量摄入对子代成年肥胖的程序化影响的具体机制尚不明确，其中UCP3基因在里面又发挥着怎样的作用，哪些因素会对它产生怎样的影响，如何正确通过这些理论制定合理的早期营养膳食等等众多问题需要有人研究和探索。故本课题拟通过研究UCP3基因在孕期低能量膳食对子代成年肥胖影响中的作用，为妊娠期妇女及新生儿不同生理阶段的合理膳食提供正确理论依据。为达到在生命早期预防肥胖的目的提供扎实可靠的实验证据，实现降低因肥胖及相关疾病所产生的国家经济负担，减轻社会压力。

　　前 言

　　肥胖是一个古老的话题，数千年前在我国的医学名著《黄帝内经》中，就对肥胖的类型、体形特征、虚实辩证要点等做了详细的阐述。西方也同样有研究，2300多年前被尊为“医学之父”的古希腊著名医生希波克拉底就认为“肥胖不仅本身是一种疾病，它还是其他疾病的预兆”，并称“突然死亡这种情况，往往胖子比瘦子更多见”。1948年，WHO正式宣布肥胖是一种疾病，并将这种疾病最终定义为“代谢综合征”，增加到国际疾病分类(ICD)中。

　　环顾全球，肥胖的发病率在发达国家居高不下，在新兴发展中国家亦呈与日俱增的趋势，而在贫困国家，肥胖和体重不达标者呈两极分化。由于肥胖是诱发高血压、糖尿病、心脑血管疾病和某些癌症等疾病最危险的因素，而这些疾病又是人类死亡的主要原因，因此，各个国家都逐渐开始重视本国的肥胖的危害，肥胖问题已经成为了世界一个重要的公共卫生问题。

　　随着流行病学的深入调查[11-16]，人们已经发现单纯的治疗或干预成人肥胖疾病，已经不能解决日益严重的肥胖问题，于是研究者们纷纷寻找新的途径。自“人类疾病起源——DOHaD”新概念的提出，国内外学者广泛关注到成人期疾病与早期发育过程有密切相关的联系[17-21]，尤其是营养在生命早期(孕期)对子代肥胖的影响，并发现肥胖具有“代谢程序化”，即机体在生长发育的关键时期(生命早期)如果受到外界因素干扰，参加脂肪代谢的器官组织在生化代谢和生理功能会为了适应环境的变化而改变，表现出脂肪代谢异常，这种异常在生长过程中将会被放大从而导致成年肥胖的发生。尽管我们已经知道从生命早期营养干预将是今后预防肥胖的主要途径，但其中许多具体因素、机制、影响尚不清楚，尤其是从基因层面的研究才刚刚起步，关于UCP3基因在孕期低能量膳食中如何影响子代成年肥胖的相关文献更是寥寥无几。因此本课题以出生后各阶段雄性子代大鼠作为研究对象，低能量膳食组孕鼠给予标准膳食70%的能量自由进食。对照组孕鼠给予标准膳食自由进食的能量。动态观察各组雄性子代大鼠生长发育各阶段体重、体脂含量、血脂水平及UCP3基因的表达;比较标准膳食孕鼠和低能量膳食孕鼠所生产的子代大鼠之间上述指标的差异，分析UCP3基因在孕期低能量摄入水平可能通过影响哪些指标(如血脂、体脂、体重等)影响肥胖的形成，探讨UCP3基因在妊娠期母体摄入低能量水平膳食的条件下对其子代成年肥胖的影响、影响的持续性及影响的机制。为妊娠期妇女和新生儿不同阶段的营养膳食提供合理建议，为早期预防肥胖提供科学依据，同时达到降低因肥胖及其相关疾病导致的社会经济负担等问题的目的。

　　材料与方法

　　一、材料

　　(一)动物来源及研究对象

　　本研究选用齐齐哈尔医学院动物实验中心提供的wistar健康成年大鼠，按雌雄比为3:1的比例交配，研究孕鼠孕期每3天的体重及进食量，孕鼠分娩后，选取其雄性子代进入实验。

　　(二)饲料来源

　　齐齐哈尔医学院动物实验中心提供的大鼠标准饲料及自行购买的饲料。

　　(三)饲料配方

　　实验选用合成饲料作为动物饲料。基础饲料配方参考了美国营养协会推荐的AIN-93G实验动物合成饲料配方，适当调整脂肪含量用猪油配制出高脂饲料。

　　(四)主要试剂和试剂盒

　　血脂测定试剂盒 北京中生生物工程高科技公司

　　DEPC Sigma Chemical Co,USA

　　氯仿 原平皓生物技术有限公司

　　异丙醇 原平皓生物技术有限公司

　　乙醇 原平皓生物技术有限公司

　　RNA提取试剂盒Trizol RNA Isolation Invitrogen Life Technologies

　　逆转录试剂盒 宝生物工程有限公司

　　PCR扩增试剂盒 宝生物工程有限公司

　　数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司

　　(五)仪器

　　1.Labo Autoclave 高压灭菌器 SANYO公司

　　2.BECKMAN Allegra 64R低温离心机 BECKMAN公司

　　3.ABI Prism 7700 Real-Time PCR System ABI Company,USA

　　4.-80℃低温冰箱 SANYO,Japan

　　5.紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司

　　6.电子分析天平 上海上平仪器厂

　　7.光学显微镜 宁波永新光学仪器有限公司

　　8.手术器具(剪刀、镊子等)

　　二、方法

　　(一)动物分组及处理

　　将Wistar健康成年大鼠用苦味酸编号，隔离饲养一周，使Wistar健康成年大鼠适应实验室的环境。在此期间，每2-3天更换一次垫料，使其自由进食及饮水，保持室内的通风透气。

　　一周后，将雌雄健康成年大鼠按照3:1的比例于每晚交配，次日清晨6-7点再将雌雄健康成年大鼠分开喂养，对雌性健康成年大鼠阴道涂片镜检，在光学显微镜下看到精子即为受孕成功，把受孕成功的母鼠挑选出来单独喂养，每日称量体重，如果体重长期无变化，视为假孕，将其排除。

将孕鼠按体重随机分为两组，一组给予标准膳食，另一组给予低能量膳食(标准膳食能量的70%)，每3天对孕鼠的体重及进食量进行称重并记录。孕鼠自然分娩后，将其所产雄性子鼠分为基础对照组和实验组，均由孕期食用标准膳食的孕鼠哺乳，21天后断乳，两组子鼠均用标准膳食喂养至成年(出生后8周);然后将基础对照组的大鼠随机分为两组：一组为基础对照组，另一组为高脂对照组;高脂对照组和实验组大鼠均高脂膳食诱导肥胖6周。大鼠肥胖的判定：实验结束时体重≥实验结束时对照组体重均值+2倍标准差(±2s)。

　　为进行良好的动态观察，实验过程中应记录子鼠每周的体重，并分别在子鼠出生、断乳、高脂诱导肥胖前和高脂诱导肥胖后各处死一批大鼠，取其血液、骨骼肌，同时摘取心、肝、脑、白色脂肪、褐色脂肪称重，液氮速冻后，-80度冰箱保存备用。酶法检测血脂水平，FQ-PCR法检测UCP3 mRNA的表达。

　　(二)血脂检测

　　紫外光分光光度计测量血脂水平，酶法检测血清中的甘油三酯水平、总胆固醇水平、高密度脂蛋白胆固醇的水平。

　　(三)指标计算

　　体脂含量(%)=[肾周脂肪(g)+睾周脂肪(g)]/体重(g)×100%

　　脏体比(%)=脏器(g)/体重(g)×100%

　　基因相对含量=未知基因mRNA浓度 / β-actin mRNA浓度

　　(四)FQ-PCR反应

　　运用荧光定量聚合酶链式反应，分两步进行。用Trizol提取组织中的总RNA，按照试剂盒说明书指示，在ABI Prism 7700 Real-Time PCR System上进行PCR的扩增，扩增体系为10μl。扩增条件见表1，引物及探针见表2。

　　表1 基因FQ-PCR的扩增程序

基因	扩增程序
UCP3	95℃ 10s 1个循环	95℃ 5s	60℃ 30s 40个循环
βactin	95℃ 10s 1个循环	95℃ 5s	54℃ 30s 40个循环

　　表2 FQ-PCR扩增的引物及探针序列

Gene Name	Sequence	Product Length(bp)
UCP3-F	5’TTTGCTGATCTCCTCACCTTCC-3’	79
UCP-3-R	5’-TCTGCACTCCTGGGTTCTCC-3’
UCP-3-P	5’-(FAM)ACACCGCCAAGGTCCGCCTGC(Eclipse)-3’
βactin -F	AGGGAAATCGTGCGTGAC	146
βactin-R	CGCTCATTGCCGATAGTG
βactin-P	5’-(FAM)CTGTGCTATGTTGCCCTAGACTTC (Eclipse) -3’

　　(五)数据处理和分析

数据以均数±标准差(±s)表示，运用SPSS 20.0统计软件，采用单因素方差分析处理数据，组间两两比较采用Dunnett's t检验，α=0.05